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威海近海沉积物中细菌的富集培养及三株拟杆菌新物种鉴定

武文杰  
【摘要】:近海海洋沉积物中蕴藏着丰富的微生物资源,可用以发掘潜在的新物种,揭示海洋沉积物中微生物的多样性。本文以威海小石岛近海沉积物样品作为研究对象,使用传统的富集分离方法并结合免培养的Roche 454 FLX高通量测序技术研究样品中微生物群落的多样性,发现潜在的新物种及微生物的区系变化规律,并验证该富集分离方法是否有利于拟杆菌门细菌的富集。本研究取得的主要成果如下:1.采用传统的富集分离方法和免培养Roche 454 FLX高通量测序技术对威海近海沉积物样品富集前后中的微生物多样性特别是拟杆菌门细菌的多样性进行了分析,发现经富集后微生物的多样性降低,但变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和梭杆菌门细菌在适度富集过程中其丰度得到增加。样品在富集培养后,细菌的总丰度和多样性均减少。使用富集分离方法共分离到538株细菌,270个物种,潜在的新物种40株,分布在四个门;其中分离得到的厚壁菌门细菌丰度最大,变形菌门、拟杆菌门和放线菌门细菌丰度依次减少,随着富集时间的增加,拟杆菌门细菌的比例呈现先增加后减少的趋势。Roche 454FLX高通量测序检测到富集前后沉积物中微生物分布有58个门,4390个OTU,丰度最大的是变形菌门细菌,而绿弯菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和拟杆菌门细菌丰度依次减少,样品中变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和梭杆菌门细菌在富集过程中被富集,丰度增加。传统的富集分离方法和免培养的Roche 454 FLX高通量测序的结果并不完全一致,传统的富集分离方法虽然有利于拟杆菌门细菌的富集但有一定的局限性,对海洋沉积物中丰富的微生物资源和微生物暗物质并没有完全开发出来。通过本次实验可对以后富集分离方法的建立和改良提供一定的参考意义。2.对近海沉积物样品中分离得到的HF08T进行了多相分类学研究,鉴定为拟杆菌门长杆菌科的一个新属新种,命名为沉积物粉色海生菌(Roseimarinus sediminis gen. nov., sp. nov)。从威海哈工大海域近海沉积物样品中分离得到菌株HF08T,该菌株为革兰氏阴性菌,不运动,直或略弯的棒状,兼性厌氧菌。菌落颜色呈粉色。氧化酶和过氧化氢酶检测均为阳性。菌株HF08T的最适生长条件:温度33℃,pH 7.5-8.0,盐度最适为2-3%(w/v)NaCl。需要NaCl生长。主要的脂肪酸是iso-C15:0, anteiso-C15:0和iso-C14:0。MK-7是主要的呼吸醌。DNA (G+C) mol%含量是44.8m01%。主要的极性脂是磷脂酰乙醇胺和两种未知成分的脂质。系统发育分析表明,菌株HF08T与相近属Sunxiuqinia, Prolixibacter, Draconibacterium, Mariniphaga和Meniscus的16S rDNA的相似度在88-90%之间。菌株HF08T (=DSM 28824T= KCTC 42261T= CICC 10901T)代表拟杆菌门长杆菌科的一个新属新种,命名为沉积物粉色海生菌(Roseimarinus sediminis gen. nov., sp. nov)。3.对近海沉积物样品中分离得到的FA423T进行了多相分类学研究,鉴定为拟杆菌门长杆菌科红树林菌属的一个新物种,命名为海洋红树林菌(Mangrovibacterium marinum sp. nov.)从威海双岛湾海洋沉积物样品中分离得到FA423T,菌株为革兰氏阴性菌,不运动,棒状,兼性厌氧菌。菌落颜色呈橘红色。氧化酶检测为阴性,过氧化氢酶检测为阳性。菌株FA423T的最适生长条件:温度33℃,pH 7.0-7.5,盐度最适为1.0-2.0%(w/v) NaCl。需要NaCl生长。主要的脂肪酸是summed feature 4 (iso-C17:1 I and/or anteiso-C17:1 B)和iso-C15:0。MK-7是唯一的呼吸醌。DNA (G+C)mol%含量是47.4 mol%。主要的极性脂是一种未知的成分的脂质和一种未知成分的磷脂。系统发育分析表明,菌株FA423T与Mangrovibacterium diazotrophicum有最高的16S rDNA的相似度(95.9%),且在系统发育树上聚到一个独立的分支。菌株FA423T (=DSM 28823 T=KCTC 42253T= CICC 10903T)代表拟杆菌门长杆菌科红树林菌属的一个新物种,命名为海洋红树林菌(Mangrovibacterium marinum sp. nov.)。4.对近海沉积物样品中分离得到的FA102T进行了多相分类学研究,鉴定为拟杆菌门海洋线菌科的一个新属新种,命名为细长屈曲海生菌(Ancylomarina subtile gen.nov., sp. nov.)。从威海双岛湾海洋沉积物样品中分离得到FA102T,菌株为革兰氏阴性菌,不运动,细胞呈细丝状,兼性厌氧菌。菌落颜色呈象牙白色。氧化酶和过氧化氢酶检测均为阴性。菌株FA102T的最适生长条件:温度28℃,pH7.5,盐度最适为2.0%(w/v)NaC1。需要NaCl生长。主要的脂肪酸是iso-C15;0。MK-7是主要的呼吸醌。DNA (G+C) mol%含量是36.5 mol%。主要的极性脂是磷脂酰乙醇胺和两种未知成分的氨脂。系统发育分析表明,菌株FA102T与Marinilum fragile JCM15579T有最高的16S rDNA的相似度(93.1%),且在系统发育树上聚到海洋线菌科的分支上。菌株FA102T (=DSM 28825 T=KCTC 42257T= CICC 10902T)代表拟杆菌门海洋线菌科的一个新属新种,命名为细长屈曲海生菌(Ancylomarina subtile gen. nov., sp. nov.)。根据拟杆菌纲系统发育树和16S rDNA的相似度,建议建立一个新目,命名为海洋滑动菌目。拟杆菌纲将包括两个目:拟杆菌目和海洋滑动菌目。


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