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类风湿关节炎发病机制中NLRP3炎症小体的作用以及类风湿关节炎疾病活动评价的新指标

杨兆文  
【摘要】:背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种自身免疫性疾病,它以滑膜炎、自身抗体、软骨和骨破坏、系统性炎症和损伤为特点,有很高的发病率、致残率、死亡率。全世界约有1%的人口患病。因为有众多患者饱受RA病痛的折磨,有必要不断探寻新的更好的治疗策略。在所有的参与RA发病的细胞中,中性粒细胞(polymorphonuclear leukocytes, PMNs)由于具有释放多种降解酶和活性氧的能力,而拥有最强的细胞毒性潜能。RA这样的炎症性疾病的炎症性微环境能使中性粒细胞的寿命延长到好几天。这种寿命的延长使得中性粒细胞能够在发生组成性凋亡或被巨噬细胞清除之前充分行使它们在炎症反应中的重要作用。近年来,中性粒细胞在各种系统性自身免疫性疾病中所起的作用引起了人们新的重视。但是,因为缺乏来自RA患者的可用的人体组织,大多数的研究都是通过动物模型来进行的,所以来自临床RA患者的真实数据还不是很多。相对于获取滑膜或关节标本的困难性而言,外周血标本更容易获取并用于研究。外周血是一种高度动态的环境,它不停地在和体内的几乎每一个组织交换信息,能反映人体内疾病的进展情况。血液中的白细胞会和体内几乎每一个组织接触并与之交流互动,它们携带了丰富的关于炎症和免疫反应的信息。在人体,中性粒细胞占循环中全部白细胞数量的60%,是含量最多的循环白细胞。目前关于中性粒细胞在RA发病中的作用值得更深入的研究。Caspase-1是参与自身免疫性疾病的公认的一个重要因子。虽然已经发现caspase-1从RA患者发病的早期阶段就存在过度活化,而且caspas e-1还被认为是治疗RA的一个潜在靶点,但是caspase-1在RA疾病进展中的作用仍然需要进一步的研究探索。近来的研究已经确定caspase-1的活化需要炎症小体的形成。炎症小体作为一个分子平台可以介导caspase-1的活化,然后促使白介素1β(interleukin-1β, IL-1β)和白介素18 (interleukin-18, IL-18)成熟和释放。NLRP3 (NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3)炎症小体是目前研究最多的炎症小体之一。现在已经发现了它与多种疾病有关。在许多疾病机制的研究中都发现了由NLRP3炎症小体引起caspase-1的活化,然而这一过程在RA疾病活动中的作用还有待研究。目的:在本研究中,我们主要调查NLRP3炎症小体在RA发病中的作用,调查RA患者外周血中性粒细胞中NLRP3炎症小体的表达及其与疾病活动的关系。方法:1.收集48例RA患者和41例正常对照血液样本和临床资料。2.用Western blot方法检测NLRP3炎症小体组成成分的蛋白表达情况。3.用实时定量反转录PCR方法检测NLRP3炎症小体组成成分的mRNA达情况。4.用ELISA方法检测NLRP3炎症小体下游分子IL-1β和工L-18的血清水平。5.对NLRP3炎症小体的表达、下游炎症因子的水平、RA疾病活动的情况三者进行相关性分析。结果:1.中性粒细胞与RA的疾病活动相关。RA患者外周血中性粒细胞计数与RA疾病活动度指数DAS28-CRP(r=0.3262,P=0.0171)和DAS28-ESR (r=0.3192, P=0.0186)正相关。RA患者的中性粒细胞中PR3的表达水平显著高于对照组(P0.0001)。而且在RA患者内部,疾病活动度指数DAS285.1的RA患者亚组中PR3的表达水平明显高于DAS28≤5.1的RA患者亚组中PR3的表达水平(P0.0129)。2.与RA疾病活动度相关的是中性粒细胞中caspase-1的活化,而不是单核细胞中caspase-1的活化。在中性粒细胞中,活化的caspase-1蛋白显著增加并与RA疾病活动度指数DAS28-ESR (r=0.4791, P=0.0178) 和DAS28-CRP (r=0.4252, P=0.0383)正相关。在PBMC中,活化的caspase-1与RA疾病活动度指数DAS28-ESR(r=0.1843,P=0.3885)和DAS28-CRP (r=0.1557, P=0.4677)无相关性。3.中性粒细胞中caspase-1的活化与血清IL-18正相关,与IL-1 β无关。中性粒细胞中,活化的caspase-1蛋白水平与血清IL-18水平(r=0.6630,P=0.0005)正相关,与IL-1 β水平(r=0.0782,P=0.7162)无关。4.与RA疾病活动度相关的是血清IL-18水平,而不是血清IL-1β水平。血清IL-18水平与关节压痛(r=0.3637,P=0.0443)、关节肿胀(r=0.3717,P=0.0395), DAS28-ESR(r=0.4473, P=0.0150)、DAS28-CRP(r=0.4739, P=0.0094)等相关。血清IL-1 β水平与关节压痛(r=0.1322,P=0.4783)、关节肿胀(r=-0.0345, P=0.8540)、DAS28-ESR (r=0.1714, P=0.3739)、DAS28-CRP(r=0.1680,P=0.3837)等没有表现出相关性。5.RA患者中性粒细胞中caspase-1的活化是不依赖于NLRP3炎症小体的。在RA患者中性粒细胞中NLRP3、ASC、pro-caspase-1的蛋白表达都比对照组明显降低(P=0.0466 NLRP3; P=0.0017 ASC; P0.0001 pro-caspase-1), 但是活化的caspase-1的蛋白表达是明显升高的(P=0.0022)。6. NLRP3 的 mRNA表达水平与RA疾病活动度负相关。(1)RA患者中性粒细胞中NLRP3和ASC的mRNA表达水平明显下降(NLRP3 P 0.0001; ASC P=0.0011);而caspase-1的mRNA表达水平没有变化(P=0.4467)。(2) NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA水平与相应的NLRP3、ASC、pro-caspase-1蛋白水平相关。(3) NLRP3的mRNA表达水平和关节压痛、关节肿胀、血沉、C反应蛋白(r=-0.3241, P=0.0246)、DAS28-ESR、DAS28-CRP(r=-0.3212, P=0.0260)、 RF、anti-CCP等临床参数负相关。(4)中性粒细胞中NLRP3的mRNA表达水平在DAS28-CRP较高的亚组(P=0.0258)和抗CCP抗体滴度较高的亚组(P=0.0197)中都是较低的。结论:RA患者中性粒细胞中caspase-1的过度活化介导了白介素18的成熟和释放,从而促进了RA的进展,这一过程不依赖于NLRP3炎症小体。背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是以对称性、进行性及侵蚀性关节炎为主要临床表现的系统性自身免疫性疾病,会导致患者的不适、残疾、药物毒性、经济损失、死亡等后果。RA的发病机制至今尚未阐明。它的发生是遗传背景、环境因素、自身免疫这三者共同作用所致,其中约60%危险因素来源于遗传因素,遗传因素在RA的发病中起了重要的作用。近年RA相关遗传易感基因研究显示,多种遗传基因变异与RA发病相关,其中最重要的是相关基因位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上。通过对SNP和RA相关性的研究,目前人们已经发现了约101个SNP位点与RA有关。NLRP3 (NLR family, pyrin domain containing 3),也称NALP3 (NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3)或隐热蛋白(Cryopyrin),是 NLRPs蛋白家族中的典型代表。NLRP3可以和ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing CARD)和caspase-1 (cysteine-aspartic acid protease 1),组成一种复合体—NLRP3炎性小体。随后,活化的caspase-1催化白介素1β(IL-1β)和白介素18(IL-18)前体蛋白,形成活性形式并分泌释放,引起各种免疫炎症反应。目前,NLRP3炎性小体在自身免疫和自身炎症等病理过程中的作用及意义备受关注。NLRP3基因,也称PYPAF1或CIAS1基因,定位于染色体1q44,其编码的蛋白产物就是前述的NLRP3蛋白。本研究关注的NLRP3 p.Q705K (rs35829419)突变是一种错义突变,也是一种功能获得性突变,NLRP3基因中Q705K基因变异可使NLRP3蛋白自身发生改变而激活,从而使IL-1β及IL-18前体蛋白的成熟和释放增高。CARD8 (caspase recruitment domain family member 8)蛋白,也称为TUCAN (Tumor up-regulated CARD-containing antagonist of CASP9)或CARDINAL (CARD-inhibitor of NF-kappa-B-activating ligand)天冬酶(caspases)的活化和核因子kappa-B (NF-κB)的活化,参与凋亡和炎症过程。此外,CARD8也参与组成炎症小体,进而通过活化caspase-1进而催化IL-1β和IL-18前体蛋白成熟形成活性形式并分泌,引起各种免疫炎症反应。CARD8基因定位于染色体19q13.33。CARD8p.C10X (rs2043211)突变是一种终止突变,产生一个提前终断的残缺蛋白。CARD8p.C10X单核苷酸多态性已被报道与RA的活动性及严重程度相关。联合分析不同基因位点的单核苷酸多态性可以有助于发现单个基因位点的单核苷酸多态性不能解释的遗传易感性。同时携带NLRP3 p.Q705K突变和CARD8p.C10X突变的携带者表现出更高的炎症小体活性,更易出现免疫反应。本研究通过对有关研究中对RA群体的NLRP3 p.Q705K和CARD8 p. C10X单核苷酸多态性研究的结果进行Meta分析,探讨它们与RA易感性的关联及关联强度。目的:1.通过Meta分析,确定NLRP3 p. Q705K单核苷酸多态性是否与RA的易感性之间有关系。2.通过Meta分析,确定CARD8 p. C10X单核苷酸多态性是否与RA的易感性之间有关系。3.通过Meta分析,确定NLRP3 p. Q705K和CARD8 p. C10X的联合多态性是否与RA的易感性之间有关系。4.通过Meta分析,确定是否NLRP3 p.Q705K位点至少有一个突变型等位基因同时CARD8 p. C10X位点也至少有一个突变型等位基因的基因型比两个位点同时为纯合野生型的基因型更易患RA。方法:1.文献检索:用数据库和网络资源检索筛选文献信息。检索范围包括:中文数据库:中国期刊全文数据库(CJFD)、中外标准数据库(WFSD)、中文科技期刊数据库(CSJD)、中国生物医学文献数据库(CBM);外文数据库:PubMed、Cochrane library、EMBase、Elsevier science direct (SD)、Web of science、SpringerLink。2.文献筛选与质量评价:按照事先制定好的文献纳入与排除标准筛选文献。用Newcastle-Ottawascale(NOS)文献质量评价量表评价纳入的研究的质量。3.数据及相关信息的提取:提取文献的第一作者、发表时间、国家、期刊,种族,语言,疾病,诊断的确定,对照来源,研究人口学特征,基因型频率,哈德温平衡检验,基因检测方法等信息。4.统计分析:使用统计软件STATA12.0 (Stata Corporation, College Station, TX,USA)。统计分析效应量采用目的基因单核苷酸多态性在病例组和对照组发生的优势比OR (odds ratio)。总体效应的统计学评估采用Z检验。分别以等位基因(Mallele vs W allele)、基因型(MM vs WW、MM vsWM、WM vs WW)、显性模型(MM+MW vs WW)、隐形模型(MM vs MW+WW)等来合并OR值。5.异质性分析:异质性检验用Cochran Q检验(P0.05有统计学意义),同时计算工2值。当有统计学意义的异质性存在,即P0.05或者I250%时,采用随即效应模型,否则采用固定效应模型。6.敏感性分析:敏感性分析用于判断去除某一研究是否会影响总体效应。7.发表偏倚分析:采用Begg法和Egger法检验发表偏倚对Meta分析结果的影响。结果:1.文献检索结果:检出文献44篇,纳入5篇。2.被纳入的研究情况:5篇病例对照研究发表于2007年至2015年,包含2705例RA患者,2711例正常对照。3.纳入研究的质量评价:用Newcastle-Ottawa scale (NOS)文献质量评价量表,纳入的5篇文献中有1篇得6颗星,3篇得7颗星,1篇得8颗星。4. NLRP3 p. Q705K单核苷酸多态性Meta分析结果:对纳入的研究进行异质性检验,各研究间无明显异质性,采用固定效应模型进行Meta分析。结果提示NLRP3 p. Q705K基因多态性与RA的发生无统计学相关性(P0.05)。剔除掉不符合不符合Hardy-Weinberg平衡的研究后,NLRP3 rs35829419基因多态性与RA的发生仍无统计学相关性(P0.05)。5. CARD8 p. C10X单核苷酸多态性Meta分析结果:对纳入的研究进行异质性检验,各研究间无明显异质性,采用固定效应模型进行Meta分析。结果提示C ARD8 p.C10X基因多态性与RA的发生无统计学相关性(P0.05)。6. NLRP3 p. Q705K 和CARD8 p. C10X联合多态性Meta分析结果:(1)选取CARD8/NLRP3 AA/CC的组合作为参照,其他的各种组合与之对比。Meta分析结果没有发现任何一种组合的0R值有统计学意义(P0.05)。(2)把NLRP3 p. Q705K位点至少有一个突变型等位基因(基因型AA或CA)同时CARD8 p.C10X位点至少有一个突变型等位基因(基因型AA或TA)的基因型合并成一组,把NLRP3 p. Q705K位点野生型基因型CC同时CARD8 p. C10X位点野生型基因型TT合并成一组,然后把纳入研究中比较两组与RA的相关性的结果进行Meta分析。异质性检验的结果卡方值7.58,P=0.056,,%=60.4%。采用随机效应模型计算,并分别用人口分层和方法学分层两种分层方法来进行异质性来源的探索。按人口分层,各亚组的结果和总体的结果没有不一致,而按照方法学分层,使用SNuPe法的亚组结果[OR=2.178,95%CI(1.085,4.373),P=0.029];与总体结果[OR=1.056,95% CI (0.545,2.046), P=0.872]明显不同,可见异质性主要来自于基因检测的方法不同。敏感性分析发现尽管存在一定程度上的方法学异质性,剔除掉任意一部分研究数据都没有能够对总体结论产生实质性的影响。结论:1.NLRP3 p.Q705K基因多态性与RA的发生仍无统计学相关性。2.CARD8 p.C10X基因多态性与RA的发生无统计学相关性。3. NLRP3 p. Q705K 和CARD8 p. C10X的联合多态性与RA的发生无统计学相关性。4.还不能认为NLRP3 p. Q705K位点至少有一个突变型等位基因同时CARD8 p. C10X位点也至少有一个突变型等位基因的基因型比两个位点同时为纯和野生型的基因型更易患RA。RA是一个多基因遗传背景与环境相互作用的疾病。多种遗传因素与多种环境因素交织在一起,使得RA患者群体内部就存在有明显的异质性,正因为这种复杂性,RA具体的机制一直没有完全阐述清楚。我们通过Meta分析证实,NLRP3 p.Q705K和CARD8 p.C10X单核苷酸多态性与RA的易感性无关,但是不排除他们与类风湿关节炎的严重程度有关的可能性,这还需要更多的实验研究。目的:类风湿关节炎(RA)是一种系统性炎症性疾病。血小板增多和贫血都是RA患者常见的关节外表现,反映了RA患者体内血小板和血红蛋白发生的异常。本研究首次调查血小板与血红蛋白的比值(PHR)这样一个新的指标在反映RA患者系统性炎症和疾病活动度的价值。方法:本研究纳入了250例RA患者和100例健康对照者。RA患者的疾病活动度分别用基于血沉和C反应蛋白的28个关节疾病活动度指数DAS28-ESR和DAS28-CRP来计算。统计分析PHR值与DAS28值之间的线性关系。同时也分析PHR值与RA患者系统性炎症指标以及心血管病相关的指标之间的关系。在一组RA患者中观察治疗前后PHR值的变化,评估PHR对治疗的反应性。结果:与正常对照比较,RA患者的血小板水平明显增高(P0.001)而血红蛋白的水平明显降低(P0.001)。与正常对照比较,RA患者的PHR值明显增高(P0.001),并与DAS28-ESR(r=0.411,P0.001)和DAS28-CRP(r=0.359,P0.001)显著正相关。此外,RA患者的PHR值与血清白介素6、血沉、C反应蛋白、白球比、免疫球蛋白G、补体C3等系统性炎症指标均有显著相关性(P均0.01)。此外,RA患者的PHR值还与已知的心血管病危险预测因子-血清唾液酸水平正相关(P0.001),与心血管疾病保护因子-超氧化物歧化酶、总胆红素、载脂蛋白A-I等负相关(P均0.001)。与治疗前相比,经过有效的治疗以后RA患者的升高的PHR值得到了明显的纠正(P0.01)。结论:PHR是一个新颖的指标,能够反映RA患者的系统性炎症和疾病活动度水平,并在预测心血管疾病和疗效评价方面具有潜在的应用价值。


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