草酸青霉纤维素降解酶系主要转录调控因子研究及菌株改良

【摘要】：丝状真菌作为植物生物质的有效降解者在全球碳循环过程中发挥了重要作用。其对木质纤维素的降解主要依靠其分泌的组分多样的木质纤维素降解酶系。利用丝状真菌来源的纤维素酶和半纤维素酶将木质纤维素转化为可发酵性糖,是目前生物燃料和生物基化工产品生产技术路线中的重要途径。然而其酶系产量和催化效率仍是限制生物质大规模工业应用的主要瓶颈。为提高木质纤维素降解酶系生产水平和酶解效率,传统突变技术取得过很大进步,但是其进一步提升空间有限。对丝状真菌木质纤维素降解酶合成及调控机制的研究将为菌株定向改良,降低酶系生产成本提供理论支撑。草酸青霉是分离自腐烂植物秸秆的纤维素降解真菌。与广泛使用的纤维素酶生产菌株里氏木霉相比,草酸青霉木质纤维素降解酶系组分更为合理,具有较高的β-葡萄糖苷酶和半纤维素酶活力。经长期诱变选育得到的草酸青霉突变株已被应用于工业规模的纤维素酶生产多年,其纤维素酶生产速率与里氏木霉工业菌株相当。草酸青霉比较基因组学研究显示其野生株114-2和高产突变株JU-A10-T在基因组水平上存在大量差异,而对存在序列变异的蛋白进行功能分析显示了转录调控因子的富集。同时,比较转录组学反映出菌株间若干生物学过程表达水平的差异。然而目前对草酸青霉木质纤维素降解酶的表达及调控机制的研究还较少,因此本论文对部分主要的纤维素酶转录调控因子进行了功能研究。在已掌握的纤维素酶表达合成调控理论的基础上,选择有效的遗传改造靶点并利用基因工程方法进一步改良纤维素酶高产突变株,可进一步降低水解纤维素底物的用酶成本。例如,目前组学分析在丝状真菌胞外木质纤维素降解酶系中鉴定到多种可能影响纤维素酶产量或催化效率的未知蛋白,尽管对其在木质纤维素降解过程中的作用机制还不清楚,但是可试探性地将其应用于菌株改良。1.草酸青霉纤维降解酶转录因子CreA、XlnR及AceA的鉴定与表达分析草酸青霉纤维素酶高产突变株JU-A10、JU-A10-T与野生株114-2胞外酶系组成存在显著差异,其中木质纤维素酶系的分泌能力增强,而淀粉酶等其它酶系比例下降。上述胞外酶系组成差异在转录水平上明显体现,即高产突变株中转录调控可能发生改变,更倾向于纤维素酶和半纤维素酶的表达。在草酸青霉114-2基因组中,利用BLASTp程序分别搜索到丝状真菌主要的保守性纤维素酶基因转录调控因子里氏木霉CREI、ACE1及黑曲霉XlnR的同源蛋白CreA、AceA及XlnR。同源比对分析发现它们含有保守的Cys2His2或Zn2Cys6类型锌指DNA结合结构域。草酸青霉主要木质纤维素降解酶基因cel7A-2和xyn10A的表达受到严格的碳源阻遏(葡萄糖)或诱导(纤维素)作用,而上述保守性纤维素酶基因转录调控因子CreA、XlnR及AceA的表达水平也相应地受到不同碳源的调控。具体地,creA和和xlnR的表达受到明显的葡萄糖阻遏而非纤维素诱导作用,而aceA在表达水平上对不同碳源并无明显响应,特别是这3个转录因子在碳源饥饿条件下均存在较高水平的基础表达,说明它们在草酸青霉基础代谢和碳源利用过程中可能发挥作用。突变株JU-A10和JU-A10-T中,xlnR、cre和aceA的表达均不同程度上调,且其表达变化不依赖于碳源,同时CreA在突变株中发生移码突变,推测它们在草酸青霉高产突变菌株酶系表达差异中可能发挥重要作用。2.降解物阻遏因子CreA调控草酸青霉木质纤维素降解酶合成和生长发育草酸青霉114-2中creA的敲除导致降解物阻遏解除,突变株在葡萄糖存在时仍能合成木质纤维素降解酶,表明草酸青霉CreA介导了纤维素酶和半纤维素酶的碳降解物阻遏效应。同时CreA的缺失引起诱导产酶条件下胞外木质纤维素降解酶活力明显提高,主要纤维素酶基因cel7A-2、cel7B和半纤维素酶基因xyn10A的表达分别为野生型菌株的12.5、3.5和1.2倍。表达谱测序分析显示部分纤维素酶、半纤维素酶和糖转运蛋白受到CreA介导的葡萄糖阻遏,同时CreA负调控草酸青霉大部分木质纤维素降解酶的表达。结合creA表达分析结果,我们推测creA在诱导条件下相对高的表达量可能与其阻遏功能的发挥有关。进一步的体外结合试验证明CreA可与主要纤维素酶基因cel7A-2结合,说明CreA可直接作用于目标纤维素酶基因的启动子来抑制它们的转录。另外,CreA缺失导致葡萄糖和纤维素条件下xlnR的表达相对于野生型分别上调5倍和2倍,说明CreA也可能会通过抑制xlnR的表达发挥其阻遏作用。本论文的研究发现XlnR能激活草酸青霉纤维素酶和半纤维素酶转录,因此CreA的这种调控机制将有利于保证其碳降解物阻遏作用的发挥。通过对突变株JU-A10中移码突变基因creA-1的敲除和野生型creA基因的回复,我们发现CreA-1突变引起了 JU-A10的部分碳降解物脱阻遏。高产菌株JU-A10中creA-1的敲除能进一步解除降解物阻遏提高纤维素酶的合成,而野生型creA基因的回复在一定程度上恢复了降解物阻遏状态。CreA-1阻遏功能的部分缺失也体现在诱导条件下。同时,草酸青霉CreA在菌丝生长发育过程中也发挥了重要作用。creA的敲除导致菌丝顶端延伸变慢,分支增多且变粗短,菌落明显变小,生孢延迟。表达谱测序分析显示CreA影响了 DNA重组和修复、氨基酸和蛋白质合成及能量代谢等基础生命过程,进而调控了草酸青霉的菌丝发育。3.XlnR激活草酸青霉半纤维素酶和纤维素酶的表达合成草酸青霉XlnR明显参与调控了木聚糖的利用。在野生株114-2中敲除xlnR,明显减弱了其在木聚糖上的生长,气生菌丝减少,菌落稀薄,但基本不影响其在木糖和葡萄糖上的生长。缺失突变株对木聚糖利用能力的减弱主要是由于β-木糖苷酶和木聚糖酶分泌量降低引起的。相反,xlnR的过表达则导致木聚糖降解酶合成量提高。同时,XlnR也在一定程度上影响了草酸青霉对纤维素底物的利用。XlnR对草酸青霉主要木质纤维素降解酶基因的表达有激活作用。其中对半纤维素酶的调控作用更明显,而中度调控纤维素酶的表达。具体地说,XlnR的缺失导致纤维素诱导条件下cel7A-2、ce/5B和xyn10A表达下调,在诱导4 h时分别相对于野生菌株下降了 79%、62%和93%。而过量表达xlnR则造成上述基因表达明显上调。XlnR对creA和aceA的表达无明显影响,并且XlnR能与cel7A-2启动子区发生体外结合,说明XlnR可能通过直接结合纤维素酶和半纤维素酶基因启动子来实现其激活功能。结合已有的功能研究,对XlnR同源蛋白进行的系统进化分析显示,该蛋白在进化过程中可能调控功能的专一性逐渐增强,更倾向于集中调控半纤维素酶或木糖代谢系统的表达。结合对XlnR及CreA的功能研究结果,发现草酸青霉纤维素酶高产突变株JU-A10和JU-A10-T中xlnR的表达量上调可能与CreA-1阻遏功能部分缺失有关,并在突变株纤维素酶和半纤维素酶的高产中发挥了重要作用。4.AceA调控草酸青霉生长发育、碳源利用和胞外多聚糖降解酶的表达合成研究结果显示,AceA在草酸青霉孢子萌发、菌丝顶端延伸和无性生殖过程中发挥了重要作用。具体地说,AceA的缺失使得草酸青霉孢子萌发速率减慢,菌丝延伸变慢且分支增多成团,菌落无法正常延展,气生菌丝明显减少,生孢过程严重受损。AceA对草酸青霉菌落形成的调控与碳源无关,这与aceA的组成型表达相吻合。特别是AceA的缺失虽然导致纤维素上的菌落生长受限,其菌落周围的纤维素水解圈仍较明显。进一步研究发现,AceA参与调控了草酸青霉胞外多聚糖降解酶的表达合成。AceA缺失突变菌株对纤维素的降解能力提高,胞外酶系组分明显改变,其中木质纤维素降解酶的比例升高,而淀粉酶比例明显下降。表达水平检测发现,缺失突变体中主要纤维素酶和半纤维素酶基因ce/7A-2、ce/7B和xyn10A的表达量相对于野生型均有不同程度的提高,而主要淀粉酶基因amy15A表达降低了 85-98%。AceA对淀粉酶表达合成的影响可能是通过调控淀粉酶转录调控因子amyR的表达量实现的。对AceA的同源蛋白进行了功能比较研究。将来自里氏木霉的ACEI回补草酸青霉AceA缺失菌株,发现两者存在一定的功能相似性和差异。其中,里氏木霉ACEI能回补草酸青霉AceA缺失造成的菌丝和菌落发育异常,同时能基本上回补AceA缺失对特定碳源的利用缺陷,但是无法回补其在甘油的生长,表明两者对丝状真菌生长发育的调控存在功能相似性,但在影响甘油的代谢利用时存在功能差异。另外,ACEI的回补没有恢复草酸青霉AceA缺失造成的酶系表达差异,表明两者在调控胞外多聚糖水解酶系的表达合成中也存在功能差异。5.PDE-01641在草酸青霉纤维素酶高产菌株改良中的应用在草酸青霉114-2基因组中,利用BLASTp程序搜索到与粗糙脉孢菌NCU05137(NCW-1)的同源蛋白PDE_01641,序列比对分析发现其在子囊真菌中是高度保守的。该蛋白在高产突变株JU-A10-T中无序列差异,但表达水平下调。在野生株114-2中敲除PDE_01641导致胞外蛋白和木质纤维素降解酶活力明显提高。突变株主要木质纤维素降解酶基因cel7A-2、xyn10A和bg11的转录水平相对于野生型上调了 101%、48%和186%,说明PDE_01641间接影响了草酸青霉木质纤维素降解酶的表达合成。为了进一步提高草酸青霉木质纤维素降解酶的产量,我们对草酸青霉高产突变株JU-A10-T中的PDE_01641蛋白进行敲除,结果显示敲除转化子的纤维素酶和木聚糖酶活力分别提高了 36%和80%。这表明PDE_01641可以作为有效的菌株遗传改造靶点对高产纤维素酶菌株进行进一步的改良。