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整合功能组学方法研究重要丝状真菌生物质降解偏好性

公维丽  
【摘要】:进入二十一世纪,农作物秸秆作为现代农业的必然废弃物未得到充分利用,常常被就地焚烧,造成环境的污染和资源的浪费。利用生物技术将其细胞壁中多糖组分高效降解转化,形成生物化工产品或生物燃料,这对我国农业及工业绿色可持续发展具有重要意义。丝状真菌可以高效分泌生物质多糖降解酶,常被用于酶制剂生产,实现生物质多糖的降解转化。由于植物进化途径及生长环境迥异,使得不同植物细胞壁多糖组成及结构存在明显异质性;而微生物伴随植物进化过程中也形成了多样的降解策略,不同微生物分泌酶种类及浓度各不相同,因此系统认识植物细胞壁的异质性与微生物降解偏好性之间的关系,将会对生物质转化利用效率提升,推动其工业化规模应用具有意义。对丝状真菌降解天然生物质偏好性的研究,将会为寻找降解特定底物的优势降解酶系,根据底物类型复配降解酶系提供指导,从而提高秸秆等生物质的利用效率,丝状真菌降解偏好性主要由基因组中生物质多糖降解酶编码基因的种类和数目、基因的转录和表达、以及酶系中不同组分的功能特异性决定,基于这一问题,本文主要以三种子囊真菌,重点以黑曲霉为研究对象对其基因组、蛋白质组及胞外多糖降解代谢组进行了系统研究,认识相应微生物的降解偏好性,取得的主要成果如下:1.利用比较基因组学方法探究重要子囊真菌生物质多糖降解酶基因组成差异,确定不同真菌降解潜能通过JGI数据库和NCBI数据库获取已测序的曲霉属、木霉属、青霉属和脉胞菌属中代表性菌株ITS序列信息,构建系统发育进化树。从UniProt数据库中下载每一菌种中所有功能注释蛋白,按照生物质中多糖结构组成和糖苷键类型,将功能注释蛋白归类分析,结果表明在不同属之间曲霉属真菌基因组中生物质多糖降解酶编码基因种类及数量较多,而青霉属真菌基因组中降解双子叶植物中含量较高的木葡聚糖和半乳甘露聚糖的酶编码基因较少,因此推测其降解双子叶植物的能力可能不高,木霉属和脉胞菌属真菌在进化关系中位于同一分支,并且两者都具有较少半纤维素酶和果胶酶编码基因,但纤维素酶基因的比例较高,这可能由于其他生物质多糖降解酶基因特化为纤维素降解酶基因,从而使其在纤维素降解中具有明显优势,基因特化现象也是丝状真菌降解偏好性的基础。同时同工酶家族分布分析显示部分家族酶类如GH11和GH10家族木聚糖酶在不同菌株之间含量比例差异明显,因此,酶系种类及其专一性家族分布的差异可导致丝状真菌降解生物质能力明显不同。2.利用比较功能蛋白质组学方法分析黑曲霉、里氏木霉和草酸青霉在固体培养条件下分泌组动态变化,确认三者在降解双子叶和单子叶植物多糖的偏好性利用玉米秸秆和小麦麸皮等农业废弃物对重要丝状真菌黑曲霉、里氏木霉及草酸青霉进行固体培养,并对其胞外酶的种类组成及浓度随时间的动态变化进行分析。结果表明在培养过程中大量的糖苷水解酶被诱导表达。利用LC-MS/MS在黑曲霉、里氏木霉和草酸青霉胞外共检测到279、161、183种蛋白,对其按照断裂生物质糖苷键类型分析发现,黑曲霉胞外蛋白质组中的酶种类可高效降解双子叶植物细胞壁多糖如(半乳)甘露聚糖、木葡聚糖和果胶主链,而草酸青霉胞外降解酶主要参与β-(1,3;1,4)-D-葡聚糖、木聚糖等单子叶植物细胞壁组分多糖的降解。里氏木霉主要分泌纤维素酶及Cip1,Cip2,Swollenin等辅助蛋白,而相对于里氏木霉和黑曲霉,草酸青霉的纤维素降解酶系组成更为合理。这从蛋白质组水平进一步确证丝状真菌胞外发挥功能的蛋白在降解不同生物质的偏好性,这为探究微生物的降解能力与其偏好性及工业合理复配酶系提高降解效率奠定了理论基础。3.利用荧光辅助糖电泳(FACE)和糖质谱定量表征木聚糖酶作用模式,建立胞外多糖降解代谢组学分析技术利用阴离子交换层析方法及大肠杆菌异源表达体系获得2个GH10家族木聚糖酶和5个GH11家族木聚糖酶,并建立FACE技术分析不同木聚糖酶降解异质木聚糖产物谱,结果表明FACE技术可以准确区分异质木聚糖酶解产物中带侧链木寡糖和不带侧链木寡糖,并可对不同种类木寡糖随时间的动态变化进行定量表征。基于对木寡糖谱随时间变化的定量分析,发现GH10家族和GH11家族木聚糖酶都可以将木聚糖迅速降解为木寡糖,而对木寡糖进一步降解速度却很慢。GH10家族和GH11家族木聚糖酶降解带侧链木聚糖主链的最小产物谱明显不同,具有家族特异性,利用LC MS-IT-TOF鉴定为2-甲基葡萄糖醛酸取代的木三糖和木四糖。对无侧链取代的木聚糖主链的降解,GH10与GH11家族木聚糖酶都可以产生单糖、木二糖、木三糖,未展现出家族专一性,而降解产物谱中寡糖种类及寡糖浓度差异应由酶活性中心亚位点的识别专一性及结合力差异导致。β-木糖苷酶的加入可以将2-甲基葡萄糖醛酸-木四糖高效降解为2-甲基葡萄糖醛酸-木三糖,但是对后者进一步高效降解需要侧链降解酶的参与。降解产物谱的动态变化反映不同家族同工酶对降解带侧链聚糖主链取代程度的偏好性不同,导致高效降解所需辅助酶种类不同,这为复杂聚糖高效降解酶系的复配指明了方向。4.限制碳源培养条件下分析黑曲霉An-76功能蛋白组动态变化,发现带侧链的木寡糖在黑曲霉降解、转运与代谢木聚糖系统中发挥重要激活作用黑曲霉An-76可以彻底高效降解利用木聚糖,利用功能蛋白质组学和qPCR方法对在木聚糖类底物生长的黑曲霉An-76胞外、胞内蛋白组及膜转运蛋白质进行系统分析,结果表明黑曲霉An-76可以有次序的分泌降解木聚糖的所有同工酶组分,木聚糖主链降解酶类优先被诱导,降解产生的木糖、木寡糖等进一步诱导侧链降解酶的高效表达,木寡糖比木糖等代谢产物更高效的激活转录激活因子XlnR的表达,从而可提高酶量表达,并提升降解效率。带侧链木寡糖可以提高侧链降解酶类、特定糖转运蛋白以及戊糖代谢途径中关键还原酶、脱氢酶的表达量,加快异质性木寡糖的降解代谢,因此有目的添加天然木聚糖的中间降解产物(带侧链木寡糖)可以诱导异质多糖降解的全酶系,并可以提高酶系表达量及缩短产酶周期。


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