耐高温β-半乳糖苷酶突变体的真核表达、高效制备及特性分析

【摘要】：β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC3.2.1.23),简称乳糖酶(lactase),普遍存在于动物组织、植物及微生物中,具有将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖的能力,并能够催化产生半乳糖寡聚体,即低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)。目前在食品工业和市场上,乳糖酶的这两个酶反应特性具有不同的实用意义。乳糖不耐症是一个全球普遍存在的生理性问题,并且人们因为诸多原因都有可能从非乳糖不耐症的群体发展成为乳糖不耐症患者,因此无/低乳糖乳制品一直以来都受到特别的关注。另一方面,近年来国内生活质量的飞升,引起了多种相关疾病(肥胖、三高等)高发,这些病种在国内有上升趋势,因此人们对膳食管理和食品安全倍加重视。研究表明GOS具有平衡肠道菌群,调节肠道酸碱度,预防便秘,改善人体肠道的生理功能,辅助钙质吸收,加速脂肪代谢,保护肝脏功能等多种特质,这使得GOS这种新型的天然食品添加剂有了广阔的市场空间。而这些方向都是乳糖酶可能涉及的市场和工业领域。国内对于乳糖酶耐高温性质和乳糖酶水解方向的研究较多,但对于GOS合成方向的研究刚刚起步。这些研究中,活性中心单个位点的氨基酸对整个乳糖酶双向性质影响的研究很少。国际上研究也比较少,只有少数科学家在做这方面相关的研究。因此在基于位点变化而影响乳糖酶分解能力或合成能力的研究上还有很大的空间。本研究通过点突变使β-半乳糖苷酶[Pyrococcus furiosus DSM 3638]415位天冬酰胺(Asn or N)突变为丝氨酸(Ser or S),突变体构建于巴斯德毕赤酵母表达质粒载体,通过转基因的方法把此线性化的重组质粒整合入巴斯德毕赤酵母细胞中,经药物筛选获取单克隆的细胞株,用以发酵表达进而制备β-半乳糖苷酶的突变体酶。研究结果表明,该突变体所产的β-半乳糖苷酶在95℃、pH=5.5时酶活力达到最高,为耐高温乳糖酶;该乳糖酶的热稳定性良好,100℃加热1h条件下,几乎不影响该乳糖酶的活性;该突变体酶在低温储存环境下活性也十分稳定;研究表明,该突变体酶水解牛奶的能力较好,可用于低乳糖牛奶及其相关制品加工中;突变后β-半乳糖苷酶的另一个方面的特性,即产生低聚半乳糖的能力的也有所提高,但不够明显,低于可工业化的水平。因此该突变株所产的乳糖酶可用于乳制品的加工行业,但不能期盼产生更多的半乳糖寡聚体。同时研究通过中试级别乳糖酶生产发现该乳糖酶的表达活力随菌体密度的增加而上升,这对于该菌株用于工业生产乳糖酶及后期纯化十分有利。由研究可推测:源自Pyrococcus furiosus DSM 3638的乳糖酶基因耐热程度较好。同时,位点氨基酸的改变影响了活性中心的构象,从而在酶的稳定性上得到了较大的提升。该突变位点所在活性中心可能更多的作用于水解乳糖的过程,但是对于GOS的合成并没有太大的关联。由此可进一步猜测,或许该耐热乳糖酶合成GOS的能力另受其他位点的影响。