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《山东大学》 2017年
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BDNF基因多态性在过敏性鼻炎中的研究及上颌窦后鼻孔息肉组织病理学和炎性发病机制的研究

金鹏  
【摘要】:研究背景过敏性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)是在鼻部黏膜接触过敏原后,由特异性IgE介导的黏膜炎症反应。AR在全世界范围内的发病率约为10%~40%,不仅严重影响患者的生活质量,也给社会带来沉重的医疗负担。近年来,AR的发病率呈逐年上升的趋势。目前,AR的病因尚不完全清楚,但个体基因和环境之间复杂的相互作用是其发病的危险因素之一。在过去的几十年中,AR基因相关研究是其病因学研究的热点。脑源性神经营养因子(BDNF)是一种分泌蛋白,是神经营养因子家族中的一员。嗜酸性粒细胞是参与AR免疫反应发生及发展的重要炎症细胞,可生成BDNF蛋白并表达其相应的受体TrkB。BDNF单核苷酸多态性(SNPs)已被证实与过敏性哮喘的发病密切相关。因此,BDNF可能与AR的发病密切相关。但目前,BDNF SNPs是否会增加中国区域人群过敏性鼻炎的患病风险,以及BDNF遗传变异对BDNF基因及蛋白表达水平的影响尚不清楚。研究方法本研究选取山东地区有典型过敏症状并且过敏原检测阳性的481例中重度变应性鼻炎患者作为实验组,健康对照组1735例;选取新加坡中国人群中典型过敏症状并且过敏原检测阳性的522例中重度变应性鼻炎患者作为实验组,健康对照组717例;提取受试者外周血DNA。自HapMap中国汉族人群(CHB)中筛选出BDNF标签SNP位点,从每一样本基因组DNA中取5ng进行多重PCR扩增,通过MassARRAY系统检测标签SNP位点,对受试者进行基因分型,评估与AR患病风险的关联。最后,通过体外及体内实验对BNDF遗传变异所产生的功能效应进行验证。研究结果在山东人群及新加坡中国人群这两个独立的群体中,BDNFSNP rs10767664均与中重度变应性鼻炎有显著相关性(P=0.039,OR=1.17;P=0.0017,OR =1.324)。山东人群中风险等位基因A在AR中的出现率为57%,高于对照组的53%。通过PLINKmeta分析将以上两个独立群体整合,BDNF SNP rs10767664仍与中重度变应性鼻炎有显著相关性(P = 0.000298,OR= 1.242)。BDNF非同义SNP rs6265与SNP rs10767664连锁不平衡,遂使用rs6265进行体外功能研究。Val/Met重组质粒转染HEK293T细胞,与空载体组相比,细胞裂解液中BDNF蛋白的表达水平均显著增高。在体内,rs6265 CC基因型者外周血BDNF蛋白水平显著高于CT型及TT型(P= 0.02,P= 0.03);rs6265 CC基因型者,外周血IgE水平显著高于TT型(P0.05)。因此,rs10767664AA基因型者更易表现为中重度过敏性鼻炎,且其血浆中BDNF蛋白及总IgE水平更高。大样本量数据eQTL meta分析显示,BDNF SNPs与外周血BDNF mRNA的表达水平具有显著相关性。结论BDNF SNPs增加了中重度过敏性鼻炎的患病风险;BDNF rs10767664 AA基因型者外周血BDNF mRNA及蛋白的表达水平更高;BDNF SNP rs10767664与过敏性鼻炎的发生密切相关。研究背景上颌窦后鼻孔息肉(AntrochoanalPolyps,ACP)约占全部鼻腔息肉的4%~6%。与临床上常见的双侧鼻息肉(bilateralnasalpolyps,BNP)相比,ACP的发病年龄较低,病变范围较局限,临床症状相对于BNP也较轻。在过去的几十年中,对于传统双侧鼻息肉发生的分子机制的基础研究众多,但对ACP病理改变及发病机制的研究极少。本研究旨在较大样本量的中国人群ACP中进行较为全面的组织病理学及炎性发病机制的相关研究,明确ACP的上皮重塑模式,对组织中常见炎症细胞的浸润进行检测,分析上皮重塑及炎细胞浸润与ACP临床特点的关系,检测ACP中辅助性T细胞、调节性T细胞及其转录因子和相关炎性介质的表达,并比较其表达与对照组鼻腔黏膜的差异。研究方法收集上颌窦后鼻孔息肉ACP 33例,传统双侧鼻息肉BNP 49例,以及行鼻中隔偏曲手术的下鼻甲黏膜50例作为对照组。通过HE及IHC染色,对组织的上皮重塑及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和FOXP3+T-reg细胞的浸润进行评估和比较。提取21例ACP及34例对照组的mRNA,通过逆转录及实时定量PCR,检测组织中Th1、Th2、Th17和T-reg细胞的转录因子及相关炎性介质基因水平的表达。研究结果与BNP相比,ACP的上皮增生及杯状细胞增生程度较轻。在本研究中,87.9%的后鼻孔息肉表现为中性粒细胞型鼻息肉,其中性粒细胞的浸润程度显著高于BNP及对照组:与对照组相比,ACP中巨噬细胞及CD8+ T细胞的浸润显著上调,但肥大细胞的浸润是下调的。在ACP组织中,FOXP3+调节性T细胞的浸润数目与中性粒细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润均呈显著正相关性;嗜酸性粒细胞的浸润程度与ACP患者的哮喘史具有显著的正相关性;巨噬细胞的浸润程度与上皮的增生程度及杯状细胞的增生程度呈显著负相关性;CD8+ T细胞的浸润程度与鳞状上皮化生呈显著正相关性。与对照组相比,调节性T细胞T-reg的相关转录因子FOXP3及炎性介质IL10在ACP中的表达显著上调。此外,IL6、中性粒细胞相关基因MPO、嗜酸性粒细胞聚集基因CCL13和CCL18在ACP中的表达显著上调,但Th1/Th2/Th17的转录因子T-bet,GATA3和RORc的表达显著下调。FOXP3的mRNA表达水平与T-bet和GATA3呈显著正相关性,但与RORc无相关性;IL6的mRNA表达水平与T-bet、GATA3和FOXP3呈显著正相关性;IL10的mRNA表达水平与T-bet呈显著正相关性;此外,MPO的mRNA表达水平与CCL18呈显著正相关性。IL10的mRNA表达水平与巨噬细胞的浸润数量呈显著正相关;MPO的mRNA表达水平与CD4+ T细胞的浸润个数呈显著负相关性,与CD8+ T细胞的浸润数量显著负相关性;T-bet的mRNA表达水平与CD8+ T细胞的浸润个数呈显著正相关性;RORc的mRNA表达水平与CD4+ T细胞的浸润数量呈显著负相关性。结论ACP的上皮重塑特点、炎细胞浸润和炎症因子表达模式与BNP有所不同;ACP中涉及复杂的炎症细胞浸润,包括显著上调的中性粒细胞、CD8+T细胞和巨噬细胞;IL6、IL10和FOXP3的mRNA的表达水平显著上调,并与其它细胞因子和炎症细胞类型的表达具有一定的相关性,可能在ACP的发病过程中起到一定的调控作用,这为进一步深入研究ACP的发病机制奠定了基础,也为ACP的诊断和治疗提供新思路。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R765.21

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