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《山东大学》 2017年
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Agrobacterium tumefaciens S33降解尼古丁的生化机制研究

于文君  
【摘要】:尼古丁是烟草及其废物中含量最高的一种有毒生物碱,能使人对烟草产生依赖性。因其易溶于水,如果处理不当,会对环境和人体健康造成严重危害。微生物以其种类繁多、代谢类型多样、适应性强且不会造成二次污染等特点成为自然界中环境污染物降解的主要类群。Agrobacterium tumefaciensS33是本实验室前期筛选获得的一株能够高效降解尼古丁的菌株,前期研究发现它以一种新的途径——吡啶途径与吡咯途径的"杂合途径"——降解尼古丁。本论文在前期研究的基础上,对菌株A.tumefaciens S33降解尼古丁杂合途径的生化机制进一步展开深入研究,为烟草废物的处理与尼古丁的转化利用提供更多的理论基础。通过对A.tumefaciens S33的基因组重新完整测序发现,该菌株基因组包含2条染色体,分别为2.49 Mbp的环状染色体和2.98 Mbp的线性染色体。分析发现,已经鉴定的尼古丁降解基因(ndhB、ndhA、hno、pno和hsh)与转座酶、接合转移蛋白、质粒分割和复制起始蛋白等蛋白的编码基因形成一个大的基因簇,该基因簇位于环状染色体的一个基因岛上。此外,在该基因簇上还发现了其它参与尼古丁降解下游途径的基因(iso、nfo、hpo和ami)。在获得S33高质量的完整基因组序列的基础上,对之前测定的转录组数据进行了重新分析,结果显示,在以尼古丁培养基培养时,S33环状染色体上的尼古丁降解基因簇中的基因表达水平显著上调。除上述已经证实直接催化尼古丁降解的9个基因外,在该尼古丁降解基因簇中还发现了paz、ald等多个基因表达水平显著上调,分析推测它们也可能参与尼古丁降解过程。另外,在本实验室前期研究的基础上,对可能催化尼古丁降解第四步反应的关键酶6-羟基假氧化尼古丁氧化酶(Pno)进行了异源表达和纯化,全波长扫描结果显示Pno含有典型的黄素和铁硫簇的吸收峰。薄板层析和高效液相色谱分析结果显示,每摩尔蛋白结合1.2molFMN;测定铁含量结果显示,每摩尔蛋白结合3.3 mol铁,这些结果与预测的Pno结合有一分子FMN和一分子[4Fe4S]型铁硫簇一致。酶活测定结果显示,Pno能够催化6-羟基假氧化尼古丁氧化生成6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶,以2,6-二氯酚靛酚为人工电子受体,该酶的催化活力可达32.2 U/mg,6-羟基假氧化尼古丁的表观K?值为0.37 mM。此外,还对催化尼古丁降解起始反应的关键酶尼古丁脱氢酶(NdhAB)进行了细胞定位和纯化。采用高渗溶液、溶菌酶和EDTA处理菌株S33细胞,离心获得周质空间组分,通过短暂超声破碎与超速离心分离制得细胞质与细胞膜组分,通过对不同组分酶活的测定,发现66%的NdhAB酶活在周质空间组分中,而90%左右的Pno和Hno酶活在细胞质中。进一步对周质空间组分中的NdhAB进行纯化、酶活测定与质谱鉴定,证实NdhAB在细胞质内合成后分泌到细胞的周质空间发挥作用,而Pno和Hno则直接在细胞质内发挥作用,这与生物信息学分析发现NdhA的氮端含有典型的Tat信号肽的结果一致。有趣的是,通过生物信息学分析发现,位于ndhAB基因上游与之相邻的ORF被预测编码电子传递蛋白假天青蛋白(Paz)。因该蛋白被预测含有信号肽,在细菌中通常也被分泌到周知空间,且其表达水平在尼古丁培养基中显著上调,推测它可能作为NdhAB的电子受体参与尼古丁降解。通过对Paz异源表达、周质空间组分提取与纯化,证实其定位于周质空间。氮末端氨基酸序列分析显示,从大肠杆菌周质空间组分纯化的成熟的重组Paz蛋白氮端的信号肽已经被切除,全波长扫描发现该蛋白具有典型的Paz的特征吸收峰(450 nm、595 nm和770 nm),且A595nm/A280nm为0.24,完全氧化态的Paz在595 nm处的摩尔消光系数为3.58 mM-1 cm-1,每分子蛋白结合1分子铜。通过酶活测定及催化产物质谱鉴定证实,Paz能够作为NdhAB的生理电子受体参与尼古丁降解,催化活力可达110.5 U/mg,每氧化1 nmol尼古丁消耗2.2 nmol氧化态Paz。以Paz为电子受体时,测得的尼古丁的表观Km值为1.64 μM,Paz的表观Km值为3.61 μM。进一步的同位素标记实验结果显示,NdhAB催化尼古丁羟基化产物6-羟基尼古丁中的氧原子来自H20。这些结果确认,Paz在S33的周质空间中作为NdhAB的生理电子受体参与尼古丁降解的第一步反应。综上结果,本论文对S33的基因组进行了完整测序,对前期测定的转录组数据进行了重新分析,通过酶纯化及性质研究对S33降解尼古丁杂合途径的关键酶展开了详细研究,首次详细研究了 6-羟基假氧化尼古丁氧化酶Pno的生化性质和催化功能;首次发现了尼古丁脱氢酶NdhAB被分泌到周质空间中,并以假天青蛋白Paz作为生理电子受体催化尼古丁的羟基化反应,进一步揭示了菌株S33降解尼古丁杂合途径的生化机制。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:X795;Q78

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1 于文君;Agrobacterium tumefaciens S33降解尼古丁的生化机制研究[D];山东大学;2017年
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