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《山东大学》 2017年
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BALB/C小鼠胚胎与成鼠皮肤无瘢痕愈合相关基因筛选、克隆与转基因研究

王鹏  
【摘要】:论文纲要皮肤组织是人体最大的器官,其主要功能为隔离和屏障作用,避免身体受到外界的感染和伤害。瘢痕(scar)是皮肤软组织和各个器官损伤后所引起局部形态和组织学及病理学等变化的统称,它是高等哺乳动物的皮肤、软组织和器官受到一定程度损伤后修复和重建过程的必然产物,是正常组织形态和功能的不完全替代。瘢痕的形成不仅影响患者的美观和心理健康,肥厚性瘢痕、瘢痕挛缩及瘢痕疙瘩更是能够引起患者的功能丧失、运动感觉障碍及婴幼儿患者的生长受限。瘢痕癌则直接威胁着患者生命安全。因此,防治皮肤软组织器官损伤后的瘢痕形成、瘢痕增生,减少瘢痕组织对患者外表、功能和心理的损害是现代医学研究的热点和难点之一。观察发现,器官再生和无瘢痕愈合往往出现在低等动物体内,高等哺乳动物皮肤软组织损伤往往以瘢痕愈合形成功能替代为终点。然而上世纪70年代Burr ington[1]发现将剖宫后经过手术的羊胚胎再放入子宫后,出生后羊羔皮肤上无瘢痕形成。随后,Harrisond[2]等对17例18-28周的人类胚胎进行手术后再放回子宫,婴儿出生后皮肤上也没有瘢痕出现,表明人类胚胎的皮肤、软组织和部分内脏器官具有创伤后无瘢痕愈合和重建的能力,并由此提出了“无瘢痕愈合(scarless wound healing)”的概念,即人类和高等哺乳动物孕早中期胚胎的皮肤软组织及部分器官具有深度创伤后可以完美修复重建且没有瘢痕组织形成的特性,这种现象说明瘢痕这种不完全功能和形态的组织替代并不是人类和高等哺乳动物皮肤、软组织和器官创伤或损伤愈合的唯一途径。孕早中期胚胎皮肤和软组织完美修复重建的主要组织学特征总结如下:①胚胎皮肤等组织损伤后无明显急性炎症反应或炎症反应维持在较低水平;②胚胎皮肤的真皮细胞外基质(E CM)中透明质酸(hyaluronic acid,HA)的含量较成体皮肤明显升高,而透明质酸酶的合成及活性明显降低;③胚胎皮肤无瘢痕愈合后真皮中各型胶原纤维呈正常网状结构整齐排列,而瘢痕组织中的胶原纤维排列杂乱无序且各型胶原蛋白比例有明显差异。根据上述结论可以得出与高等哺乳动物胚胎皮肤等组织无瘢痕愈合相关的几个要素:(1)胚胎所处子宫内环境因素:无瘢痕愈合与胚胎伤口周围羊水提供的子宫内环境有特定关系。羊水中含有较多的前列腺素(prostagla ndin,PG)、透明质酸等已证实能够促进伤口愈合的活性物质,这些活性物质在胚胎创伤后组织修复和重建中发挥了积极作用。实验证实:羊水本身既有提高胶原酶(collagenase)活性的作用,也有降低透明质酸酶(hyaluronidase)、弹性蛋白酶(elastase)和组织蛋白酶(cathepsin)等多种降解酶活性的作用,羊水就是通过影响与胶原和透明质酸的合成与降解相关的各种酶的活性达到调节胚胎伤口中特定胶原(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型)合成比例与增加透明质酸含量的作用。(2)无论是胚胎还是成体哺乳动物,皮肤、软组织和器官的成纤维细胞(fibro-bl ast,FB)是损伤修复的主要功能细胞,成纤维细胞向伤口的游走速度和时机,各型胶原蛋白合成、分泌及其比例在伤口的愈合过程起到了关键作用。实验证实,孕早期胚胎皮肤伤口中成纤维细胞较成人皮肤伤口成纤维细胞的游走能力明显增强,同时胚胎皮肤伤后3-5天创面组织中即可见到大量成纤维细胞聚集,而成人伤后7天的创面才出现成纤维细胞游走和分泌。(3)胚胎皮肤软组织细胞外基质有其特殊之处:胎儿组织细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的组成成分与成人有明显差异,成人皮肤伤口内透明质酸和纤维蛋白仅仅在创伤早期少量分泌,然后迅速分解,并且被各型胶原蛋白(其中Ⅰ型胶原比例75%,Ⅲ型胶原比例25%)替代;而胎儿皮肤伤口的ECM成分和含量与胎儿正常皮肤相同,透明质酸含量较成体皮肤显著升高,胶原纤维(其中Ⅲ型胶原比例60%)呈规则网状排列。随着妊娠时间延长,孕后期开始胚胎皮肤愈合模式从无瘢痕愈合逐渐转变为瘢痕愈合直至出生后。如果能够在成体皮肤软组织和器官实现无瘢痕愈合,就可以从根本上解决组织损伤后瘢痕愈合引起的一系列问题,从而获得损伤及手术后皮肤、软组织和器官完美重建甚至组织器官再生的理想化结果。几十年的研究表明瘢痕形成主要与三方面因素相关:1、细胞外基质的合成与分解失衡。Sato M等[3]的研究表明在三维立体培养体系中,瘢痕疙瘩(keloid)和肥厚性瘢痕(hypertrophic scar,HTS)的前α 1(Ⅰ)、前α 1(Ⅲ)胶原的mRNA水平比正常水平高20倍。Friedman DW等[4]的试验表明前α 1胶原基因在keloid和HTS中的翻译效率均有增高,但只有在keloid中发现前α 1胶原基因的mRNA水平随Ⅰ型胶原生成量增加而相应稳定增长。Arakawa等[5]用Northern印迹杂交的方法发现HTS中编码胶原酶mRNA含量和表达显著降低,同时胶原酶的活性明显下降。说明创面成纤维细胞中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的过度合成及分解降低是肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩发生的关键因素。2、多种类型细胞因子在瘢痕愈合过程中有重要双向调节功能。转化生长因子β1,2,3(transforming growth factor-β1,2,3,TGF-β1,2,3)是当前已确认的与keloid和HTS形成密切相关,同时也是研究最多的细胞因子之一。Occlestong[6]等通过在成年小鼠,大鼠和猪的伤口中(模拟子宫内胚胎内环境)加入相应抗体降低PDGF、TGFbetal和TGFbeta2的表达或人为加入外源性TGFβ 3,均获得了类似胚胎皮肤无瘢痕愈合的结果。说明成体哺乳动物损伤的皮肤及软组织在特定条件下也可以模拟类似胚胎无瘢痕修复的过程。TGFβ 3是哺乳动物胚胎组织无瘢痕愈合的关键因子。在成体哺乳动物皮肤创面添加外源性TGFβ 3显著降低了伤后早期细胞外基质中胶原蛋白等的沉积,而这些蛋白质分子的大量沉积影响了伤口真皮组织的塑形和重建。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)[7]不仅在促进神经系统发育及分化、维持神经系统正常功能、调节神经肽分泌等方面扮演重要角色,同时有促进损伤修复、参与新的毛细血管生成等重要功能。Rapala K等[6]的研究证明IL-1β和PGE2能够少量提高前α 1(Ⅰ)、前α 1(Ⅲ)胶原的mRNA水平,却分别减少胶原产量15%和34%。Cao PF等[9]证实HOXA9基因具有诱导皮肤表皮干细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)从而引起 HTS和keloid中血管过度增生。3、遗传学机制在瘢痕、肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩的生成中扮演主要角色。Tsou R等[10]使用基因芯片检测技术,通过普通瘢痕和HTS与正常皮肤比较发现有142个基因过量表达,同时71个基因表达量降低。Stelnicki EJ[11]通过比较胚胎和成体皮肤的基因表达,发现两者有多个同源异型基因的特异表达(如:HoxB13,PRX-2,MSX-1,MSX-2,M0X-1等),认为这些基因在胚胎和成体皮肤中差异表达可能是胚胎皮肤完美重建和修复的关键因素。在疾病基因组研究中目前经常采用的差异显示技术(DD-PCR)、Northern杂交、点杂交和基因芯片技术(genechip)等方法虽然能够全面显示两个样本间mRNA的差异,但是容易遗漏微量存在的特异表达基因mRNA携带的大量遗传信息并且假阳性率明显偏高或者只能够比较已知基因的差异,无法筛选未知基因。据此我们设计了本试验,采用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),分别抽提BALB/C小鼠孕14天鼠胚皮肤组织的mRNA和3月龄BALB/C小鼠皮肤组织的mRNA为试验材料,通过双向消减杂交技术、抑制性PCR技术和巢式PCR技术,筛选并克隆分别在两种皮肤组织中特异表达的共23个cDNA片段并构建了两个相应的cDNA文库。其中获得16个在鼠胚皮肤特异表达的cDNA片段和7个在成鼠皮肤特异表达的cDNA片段,这些cDNA片段均有可能与瘢痕形成或无瘢痕愈合有关。随后将筛选的cDNA片段分别进行克隆、基因测序、网上查新,最后使用NCBI的blast和DNAstar等分子生物学软件进行同源性分析。发现多数cDNA片段源于已知基因,其中大部分与各型细胞增殖和凋亡相关,其中2个源于鼠胚皮肤的cDNA片段未曾报道。我们在将前面获得的两个与无瘢痕愈合相关的未知基因(F32-5、F4-4)进行了克隆并且与真核表达载体pcDNA3.1构建复合体,在体外分离并培养BALB/C小鼠成鼠皮肤成纤维细胞达到稳定传代。将两个未知基因通过转基因技术转染体外培养小鼠皮肤成纤维细胞,通过形态学观察及生长曲线发现转染细胞有增殖活跃的现象。第一章BALB/C小鼠胚胎与幼鼠皮肤无瘢痕愈合基因的筛选与克隆研究目的:通过应用双向抑制性消减杂交技术(SSH)、抑制性PCR技术和巢式PCR技术筛选并克隆分别在孕中期(孕14天)及3月龄BALB/C小鼠皮肤中差异表达的与创伤愈合相关的基因。方法:自3月龄小鼠及孕14天胚胎小鼠皮肤取材,分别提取总RNA及mRNA。获得的mRNA样品通过紫外分光光度计及1%琼脂糖凝胶电泳进行定性和定量并排除DNA污染。应用SSH等分子生物学技术筛选出分别在胚胎小鼠及3月龄小鼠皮肤中特异表达基因的cDNA片段并进行克隆。结果:通过试验,获得了 16个在BALB/C小鼠胚胎皮肤中特异表达的cDNA片段,7个在成鼠皮肤中特异表达的cDNA片段。将23个cDNA片段分别进行克隆、测序和测得基因序列的同源性分析。证实其中部分为已知基因(rps29,eef-1α,tieg,rps15,nedd5(SEPT2),cdcrel-1(SEPT5)和endoa)的 cDNA 片段,其中rps29[12]基因已确认有抑制成纤维细胞增生、促进其凋亡的作用;endoa[13]与eef-1α[14]基因表达产物有调节成纤维细胞和表皮细胞增殖及凋亡的作用。rps 15[15]在多种肿瘤中表达活跃,如胰岛细胞瘤,食道癌,结肠癌等。另外获得源自BALB/C小鼠胚胎皮肤的特异表达性基因F32-5和F4-4,这两个基因未见报道。结论:通过试验获得多个已知的与表皮细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞增殖与凋亡有关基因,以及两个源于BALB/C小鼠胚胎皮肤新的与创伤愈合有关基因。这些在鼠胚皮肤和小鼠皮肤中特异表达基因可能与鼠胚皮肤无瘢痕愈合现象密切相关,为其遗传学基础。第二章鼠胚皮肤特异表达新基因的转基因研究目的:进一步通过转基因技术,研究前面筛选出的两个与无瘢痕愈合相关新基因转染对体外培养成纤维细胞的影响。方法:在体外分离培养BALB/C小鼠成鼠背部皮肤的成纤维细胞并稳定传代,将携带外源插入片段的质粒载体pcDNA3.1/F32-5、pcDNA3.1/F4-4导入体外培养传代的成纤维细胞中,并观察基因转导是否会干扰成纤维细胞的增殖和凋亡。结果:大体形态观察转染目的基因后体外培养成纤维细胞有增殖活跃现象,细胞生长曲线显示转染后成纤维细胞比未转染细胞增殖速度明显加快且凋亡减缓。结论:两个新基因转染均有促进体外培养成纤维细胞增殖和减缓凋亡的作用。表明这两个新基因与鼠胚皮肤无瘢痕愈合能力密切相关,是BALB/C小鼠鼠胚皮肤无瘢痕愈合的调控基因。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R622

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