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长链非编码RNA-ROR在肾癌中的表达及临床意义的研究

石建国  
【摘要】:肾癌是泌尿系统中最常见的肿瘤之一,发病率呈逐年上升趋势,在成人恶性肿瘤患者中占据2%到3%。虽然已经积极接受治疗,但是对于肾癌患者而言,五年的生存期也只有大概55%,并且转移性肾癌患者史是还不足10%。所以,对肾癌进行深入分析,研究发生和发展的重要分子机制,以及找寻一种可靠安全的生物标志物,对于肾癌患者的生活质量以及生存率的提高具有重要意义。随着经济社会的快速发展,测序技术也得到了飞速的提高,在肿瘤性疾病方面展开的研究更为深入,人们开始普遍关注长链非编码RNA,其属于之前被认为无任何功能基因组转录环节的“噪音”。Lnc RNA就是核苷酸的数量超过了 200个,并且无法翻译成蛋白质的RNA。它的序列原件非常保守,空间二级结构较为特殊,并且还具有复杂的亚细胞定位,可以存在胞浆或者细胞核中。它一般是通过表观遗传学等方面来对基因进行调控,并且如果它表达异常,则和众多疾病之间存在紧密的联系。长链非编码 RNA-ROR(Large intergenic non-coding RNA-regulator of reprogramming,LincRNA-ROR)即LncRNA-ROR作为一种最新发现的,能够针对细胞重编程过程具有重要调控作用的长链非编码RNA。现有的研究表明,ROR在诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)形成、DNA 损伤、氧化应激等过程中发挥重要的作用;此外,在肿瘤中,目前发现lncRNA-ROR与乳腺癌、肝癌的发生、转移等密切相关。目前还未见LncRNA-ROR在肾癌组织表达情况及其与肾癌病理特征关系的研究报道。本研究通过检测肾癌组织中LncRNA-ROR的表达,分析肾癌组织中LncRNA-ROR的表达水平与肾癌临床病理资料的相关性,为揭示肾癌发生机制及发现新型肾癌诊断分子标记物提供重要的线索。本研究内容分为两个部分:第一部分长链非编码RNA-ROR在肾癌组织中的表达及其与临床病理和预后的关系研究目的:通过对LncRNA-ROR在肾癌组织中的表达水平,同时分析LncRNA-ROR的表达水平与肾癌临床病理资料的相关性。研究内容:1.样本收集选取在辽宁医学院附属第一医院泌尿外科就诊的患者,经病理确诊的肾癌患者36例,在术中切除肿瘤组织标本和癌旁正常组织,并统计其临床资料。2.采用实时定量PCR方法检测36例肾癌组织及癌旁正常组织中LncRNA-ROR的表达水平。3.分析在肾癌组织标本中LncRNA-ROR表达和其临床特征及预后的关系。研究结果:肾癌组织中LncRNA-ROR表达水平(10.84±4.53)高于癌旁组织LncRNA-ROR 表达水平(4.15 ±1.38),差异有统计学意义(p0.05)。LncRNA-ROR表达量与肾癌患者年龄和性别无关,和临床分期与肿瘤大小有关。研究结论:LncRNA-ROR在肾癌组织中表达显著升高,与LncRNA-ROR在癌旁组织中表达相比,差异具有统计学意义;LncRNA-ROR表达量与肾癌患者年龄和性别无关,和临床分期与肿瘤大小有关。LncRNA-ROR可作为判断肾癌预后的一项潜在的肿瘤标志物。第二部分长链非编码RNA-ROR在肾癌细胞系中的表达及其影响肿瘤增殖的可能机制研究目的:分析LncRNA-ROR在肾癌细胞系的表达水平,探讨其影响肿瘤增殖的可能机制。研究内容:1.采用实时定量PCR检测LncRNA-ROR在肾透明细胞癌细胞系Caki-1细胞、Caki-2细胞的表达情况。2.构建LncRNA-ROR shRNA质粒,将其转染至肾癌细胞系中,RT-PCR检测LncRNA-ROR表达情况,下调LncRNA-RoR的表达后采用CCK8和凋亡试剂盒测定肾癌细胞的增殖和凋亡情况。3.采用western blot分析测定肾癌细胞中LncRNA-ROR受抑制后P53和c-Myc的表达水平。4.采用CCK8法检测肾癌细胞低表达lncRNA ROR、抑制p53和过表达c-Myc后细胞增殖情况。研究结果:1.LncRNA ROR 在肾癌 Caki-1 细胞表达水平为(11.22±3.45),在 Caki-2细胞表达水平为(17.47±1.39),LncRNA ROR在正常肾小管上皮HK细胞表达水平为(3.39±0.43),LncRNAROR在肾癌细胞中表达量明显高于HK细胞,差异具有统计学意义(p0.05)。2.成功构建LncRNA-RoR shRNA质粒,将其转染至肾癌细胞株中,qRT-PCR技术检测lncRNA-ROR表达情况:Caki-1细胞中ROR的表达量(0.89±0.12)显著降低,和对照组(5.36±1.16)相比差异具有统计学意义(p0.05);Caki-2细胞中ROR的表达量(1.21±0.06)显著降低,和对照组(12.48±1.51)相比差异具有统计学意义(p0.05)。3.沉默LncRNA ROR基因导致肾癌细胞增殖能力下降,与对照组相比差异有统计学意义(p0.05);沉默LncRNAROR基因导致肾癌细胞凋亡增加,与对照组相比差异有统计学意义(p0.05)。4.抑制LncRNA-ROR表达能够诱导增加p53基因的表达,与对照组相比,差异有统计学意义(p0.05);抑制LncRNA-ROR表达能够诱导减低c-Myc的表达,与对照组相比,差异有统计学意义(p0.05)。5.低表达lncRNA ROR同时抑制p53后细胞增殖率高于单独低表达lncRNA ROR后细胞增殖率,差异均具有统计学意义(p0.05);低表达LncRNAROR同时过表达c-Myc后细胞增殖率高于单独低表达lncRNA ROR后细胞增殖率,差异均具有统计学意义(p0.05)。研究结论:LncRNA-ROR在肾癌细胞中表达显著升高;沉默LncRNA ROR基因导致肾癌细胞增殖能力下降,凋亡增加,可能通过调整p53基因和c-Myc基因的表达调整细胞的增殖能力的。


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