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纤维粘连蛋白Fibronectin通过JAK/STAT3信号通路调控Neuroligin基因表达在先天性巨结肠发病机制中的研究

郑懿  
【摘要】:目的:先天性巨结肠(Hirschsprung' s disease,HSCR)是以部分或全部结肠的肠神经节细胞缺失为病理特征的一种儿童消化系统发育畸形,又被称作为赫尔施普龙病,病变所累积的肠管表现为持续性痉挛狭窄,最终造成近端结肠蠕动功能代偿性增强而扩张肥大,引起患儿摄食困难,严重便秘,生长障碍和腹胀,严重者可出现便血,发热和腹泻(先天性巨结肠肠炎,hirschsprung associated enterocolitis,HAEC),甚至新生儿肠梗阻或肠穿孔,危及病人生命,导致病人死亡。HSCR属于小儿外科常见且高发的消化道畸形疾病,在新生儿中其发病率大约为1:5000,仅次于直肠肛门畸形,男女发病率之比约为4:1。目前对其病因学研究的学说有很多,认为其发病基础是由于迷走神经嵴衍生的前体细胞形成肠神经系统(enteric nervous system,ENS)时,这一过程受到各种不良因素影响导致前体细胞的迁移、定植、分化功能发生异常,造成受累肠段未形成神经节,因此该疾病也称之为无神经节细胞症,但是其中涉及的分子机制并不清楚。HSCR诊断的金标准是直肠抽吸活检术,但由于疾病症状不典型,很多正常儿童也存在腹胀、便秘和呕吐等,且基因检测涉及的数据分析过于复杂,以及国内具体国情等原因,目前国内诊断主要依靠临床表现和辅助检查结果,术前诊断较困难。同时治疗方面也有部分儿童手术效果欠佳,且缺少明确的随访指标,因此HSCR的病因学研究与临床研究一直是小儿外科的研究热点之一。对HSCR发病原因的解释目前主要有两种学说,即“基因异常”学说,和“微环境异常”学说。“基因异常”学说认为,大约20%的患儿具有明确的家族史,如父母或兄妹发病则近亲发病的风险大大增加,通过基因检测可以发现明确的基因异常或缺失,常见的与发病有关的基因如原癌基因酪氨酸蛋白激酶(RET),内皮素B受体(EDNRB),转录因子SOX10或胶质细胞源性神经营养因子基因(GDNE)等。随着研究的不断深入,学者发现HSCR的流行病学特征是大部分病例并无家族聚集性,而都属于散发病例,所以这种单纯的“基因异常”学说无法全面且合理地阐述HSCR的发病机制,因此又有学者提出了新的观点,即“微环境异常”学说。该学说认为胚胎干细胞维持正常发育方向不仅需要特定时间点特定基因的表达,也需要特定的空间和微环境的改变,当其周围的微环境出现异常时,神经嵴细胞沿迷走神经干方向分化发育成ENS的过程也会发生异常,从而导致HSCR的发病。这些非遗传因素多种多样,包括脑-肠轴(Brain gut axis,BGA)功能失衡,肠道免疫功能紊乱,肠黏膜屏障功能破坏,局部炎症因子浸润等多个方面,其中有研究显示细胞外基质成分的改变,可以导致肠神经嵴细胞过早定植、分化、粘附和成熟,而无法正常迁移到特定位置,造成了受累肠段尤其是结肠末端神经丛的神经元及神经胶质细胞缺失,但也有学者提出与ENS共同来源于外胚层的HSCR患儿盆腔神经丛所支配的器官却有正常发育的神经节细胞,故“微环境异常”学说在HSCR的病因学研究中也是片面的。同时由于发病机制的基础理论不完善,也导致了临床工作中HSCR诊疗方面的诸多问题。在中枢神经系统研究中,曾有学者提出中枢神经细胞和神经网络的发育是一个兼具时空特性的过程,即既需要特定基因在特定时间的表达调控,也需要外界环境在结构空间中的影响。鉴于中枢神经系统和肠神经系统的相似性和相互联系,本课题借鉴了中枢神经系统研究的方法论,提出了基因因素和微环境因素相互结合、相互作用,影响胚胎时期肠神经系统发育异常导致HSCR发病的假说。综上所述,本课题拟从ENS神经突触发育异常方面,综合“基因异常”学说和“微环境异常”学说两方面的特点,提出基因-环境相互作用的理论,研究已在中枢神经系统(CNS)中研究较为深入的突触后膜蛋白的编码基因Neuroligin(Nlgn)基因及细胞外基质中的主要成分纤维粘连蛋白Fibronectin(FN),在HSCR患儿ENS中的表达情况及相互作用,并进一步研究分泌型FN在HSCR患儿血清中的表达,从ENS异常发育的角度讨论Nlgn基因及FN表达和变化与HSCR发病的关系。同时寻找特异性高且经济的血清诊断指标,为HSCR的发病机制提供理论基础,为HSCR的临床诊疗提供实践方向。方法:本研究所取肠组织及血液样本均来自2013-2015年就诊于山东大学齐鲁医院小儿外科的住院病人,其中57例术后病理诊断为HSCR的患儿(1个月-5岁,男37例,女20例,短段型33例,长段型24例),57例同时期诊断为腹股沟斜疝的患儿(indirect inguinal hernia,IIH)。取HSCR患儿术后切除的结肠组织分为狭窄段(无神经节区)、移行和扩张段(有神经节细胞区)和切缘段(正常区)。将取自三段的部分手术结肠组织在PBS中清洗后迅速置于液氮中保存,用于 Western blot 和 qRT-PCR 检测,观察 Neurol igin(Nlgn)、Fibronectin(FN)和JAK/STAT信号通路在各组间的表达情况;剩余的结肠组织清洗后置于4%多聚甲醛溶液中固定,石蜡包埋切片,用于免疫组织化学和免疫荧光染色,观察Nlgn、FN和Stat3在ENS中的表达。于患儿第一次入院检查时,取HSCR和IIH患儿的血液,离心后取上层血清,分装并标记后可存于-80℃低温冰箱备用,用酶联免疫吸附测定(Elisa)技术检测不同组间血清分泌型FN的含量,本研究比较了 HSCR患儿与non-HSCR患儿,以及长段型HSCR患儿(L-HSCR)与短段型HSCR患儿(S-HSCR)的差异,评价血清FN含量对HSCR诊断和临床分型的重要意义。取清洁级Wistar大鼠雌雄各48只,随机两两配对,见孕栓确认受孕后,孕鼠分笼单独培养至孕龄第16、18和20天,麻醉处死取胎鼠及出生第一天乳鼠的结肠区域全层肠组织,按前述方法检测Nlgn、FN和Stat3的表达,研究在胚胎发育过程中三者的表达情况和相互关系。常规细胞培养方法培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12(低分化)(该细胞系与肠神经嵴细胞起源相同均来自外胚层同一位置,神经科学中多用于神经元方面的研究),通过病毒转染制备低表达FN 的 FN-Knockdown-PC12 细胞系(KD),Westem blot 检测 Nlgn 及 JAK/STAT3信号通路的表达,并研究其对细胞增殖、迁移和分化功能的影响。本研究所得实验数据均以“均数土标准差”表示,未配对t检验用于两组组间的比较,单因素方差分析(one-way ANOVA)用于三组以上组间差异的比较。SPSS 10.5统计软件和GraphPad Prism 5.0软件用于数据的统计分析,p值小于0.05被认为具有显著的统计学差异。结果:(1)通过对不同胎龄胎鼠结肠组织的检测,发现随着胚胎发育的不断成熟,FN的表达降低,而Nlgn的表达增高,同时JAK/STAT3信号通路被激活。(2)对HSCR患儿不同肠段肠组织的免疫组化染色结果显示从狭窄段,扩张段到正常段FN的表达依次降低,而Nlgn的表达依次增加,JAK/STAT3信号通路被激活。免疫荧光染色显示FN蛋白与Nlgn蛋白主要表达于肌间神经丛,且两者可能有相互作用。(3)Elisa检测结果显示HSCR患儿血清中分泌型FN的含量可能与HSCR的发病有关,HSCR组血清中FN的含量相较于non-HSCR组明显增多,但长段型HSCR与短段型HSCR组间无明显差异。(4)qRT-PCR和Western blot检测证实KD组(低表达FN的实验组)PC12细胞较NC组(正常表达FN的对照组)FN表达减少,但Nlgn表达增多,且磷酸化Stat3(p-stat3)水平表达也增多。(5)白介素-6(IL6)作为JAK/STAT3信号通路激活剂,可以活化Stat3,随着时间和浓度的增加,Stat3及磷酸化Stat3水平增加,且Nlgn的表达也增加。(6)MTT检测显示FN-KD-PC12组随着时间增加相较于对照组细胞增殖被抑制,细胞划痕结果显示24H时FN-KD-PC12迁移率增加,而48H时迁移率反而降低,细胞集落形成实验显示FN-KD-PC12组形成的细胞克隆数较对照组减少,以上结果差异均具有显著统计学意义。(7)形态学上,细胞培养中撤除马血清,增加胎牛血清含量后,两组PC12细胞均从低分化状态向高分化状态分化,FN-KD-PC12分化更快,神经元结构更明显。结论:综上所述,根据以上研究结果,本研究我们可以得到以下结论:(1)在胚胎神经嵴细胞逐渐发育成ENS的过程中,随着胚胎越来越成熟,FN与Nlgn存在负性相关,说明FN可能与ENS的形成和突触成熟有关,且这一过程有JAK/STAT3信号通路的参与。(2)FN与Nlgn均表达于结肠组织的肌间神经丛,且与HSCR患儿肠段病变的严重程度有关,这种变化可能会导致肌间神经丛ENS的异常,而突触功能的异常会影响ENS中神经信号的传导,引起病变肠段持续性痉挛,导致HSCR的发生,这一过程也与JAK/STAT3信号通路的异常激活有关。(3)血清FN含量的检测及其在不同实验组间的差异,提示FN对HSCR的术前辅助诊断可能具有重要的临床意义,但该指标并不与HSCR的临床分型以及疾病的严重程度相关,为HSCR的诊断或可提供新的参考依据(4)体外细胞实验证实FN可以通过JAK/STAT3信号通路调控Nlgn的表达,影响ENS的发育,FN的变化可以抑制细胞的增殖、定植及迁移功能,但这一影响可能是双向的,应连贯的看待整个胚胎发育过程中神经嵴细胞时间和空间上的动态变化过程。我们的研究将基因因素和微环境因素相结合,从基因-环境相互作用的角度研究了 HSCR的发病机制并初步探讨了其中涉及的分子机制,对该疾病的诊疗提供了理论基础与临床研究方向。


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