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《山东大学》 2018年
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组蛋白乙酰转移酶MOF在炎症及肿瘤中的作用及其调控机制研究

杨阳  
【摘要】:组蛋白乙酰化是组蛋白翻译后修饰的一种的重要方式,在调控真核生物的基因表达中发挥着至关重要的作用。组蛋白乙酰化可参与多种细胞生物过程,因此,其异常调控与人类的多种疾病发生相关。这一修饰方式由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰转移酶(HDACs)共同调节。MOF,也称MYST1或KAT8,是组蛋白乙酰转移酶MYST家族(Moz-Ybf2/Sas3-Sas2-Tip60)的一员。MOF存在于两种蛋白复合物(MSL和NSL)中发挥其生物学功能。这两种复合物均可催化组蛋白H4第16位赖氨酸(H4K16)的乙酰化,而NSL复合物还可乙酰化H4K5和H4K8位点。MOF可调控多种细胞过程,在基因转录活性调控、维持基因组稳定性、DNA损伤修复、细胞周期调控及早期胚胎发育中发挥着重要作用。MOF及其相关复合物活性异常可引起严重的细胞功能障碍,从而导致细胞死亡或细胞恶性增殖。研究证明,MOF及其作用底物H4K16的乙酰化水平缺失已成为人类肿瘤的一个普遍标志。但也有研究发现MOF在非小细胞肺癌组织中高表达,可见MOF在肿瘤发生中的调控作用是复杂多样的,这提示我们MOF在不同肿瘤中的可能存在不同的调控靶点。MOF除了在肿瘤疾病中发挥重要作用外,有研究报道MOF可调控T细胞的分化,T细胞特异性敲除MOF可导致小鼠免疫功能丧失,这表明MOF在调控T细胞功能中的重要性。另有研究报道在炎症性肠病患者的结肠组织中H4K16的乙酰化水平存在异常,提示MOF可能在炎症性疾病中同样发挥重要作用。本研究分为两个部分,第一部分初步探讨了 MOF在实验性结肠炎小鼠炎症发生中的作用及可能的调控机制,第二部分研究了 MOF对乳腺癌中雌激素受体ERα表达的调控作用及机制,本研究的发现及得出的结论将丰富我们对MOF调控炎症疾病及乳腺癌肿瘤作用机制的理解,并可能成为一个新的治疗靶点。第一部分组蛋白乙酰转移酶MOF在炎症性肠病中的作用及调控机制研究目的:明确组蛋白乙酰转移酶MOF在炎症性结肠病中的作用,通过葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型研究了 MOF在小鼠实验性结肠炎发生发展中的作用,初步探讨其可能的调控机制。研究方法:1.葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠结肠炎发生过程中MOF的表达变化选择6-8周龄雄性C57BL/6J野生型小鼠,收集饮用3.5%DSS诱导不同时间(第0、3、7天)结肠炎小鼠的结肠组织,提取RNA、蛋白和制备组织切片,分别利用RT-qPCR、Western blotting、组织免疫化学染色法,检测MOF和H4K16ac在炎症发生过程的表达情况。2.MOF基因缺失对DSS诱导小鼠结肠炎发生发展的影响通过Mofflox/flox和ER-Cre转基因小鼠杂交获得基因型为Mof flox/flox;-Cre+的小鼠,利用Cre/loxP重组酶系统,腹腔注射他莫昔芬(TAM)诱导Cre重组酶表达而获得Mof基因敲除小鼠(Mof-cKO)。选择6-8周龄雄性的Mof fl/fl;ER-Cre-(对照)和Mof-cKO小鼠进行实验,分别给予正常饮水和3.5%DSS溶液建立结肠炎模型。实验过程中记录小鼠体重变化、血便情况,结肠长度,对结肠组织切片进行HE染色并做组织病理学评分。3.MOF对Th17细胞相关基因表达的影响3.1 Western blotting检测MOF对I117a蛋白表达的影响;3.2 RT-qPCR检测MOF对Th17细胞相关因子表达的影响,包括Thl7细胞分泌因子I117a和1122,转录因子RORyt、RORα和Sata3,分化调控因子TGF-β1 和 I1-6;3.3用MOF抗体进行ChIP-qPCR,检测MOF在I117a和RORyt基因启动子结合情况。4.RNA-seq分析敲低MOF对结肠组织基因表达谱的影响筛出炎症相关的差异表达基因,分析其参与的信号通路。研究结果:1.RT-qPCR 和 Western blotting 结果说明,MOF 和 H4K16ac 在 DSS 诱导结肠炎过程中表达上调;2.IHC染色结果发现,在小鼠结肠炎发生过程中MOF主要分布在结肠组织黏膜层细胞中;3.Mof敲除后可改善小鼠的结肠炎症状,表现为体重下降程度减小,结肠缩短程度减小,HE染色结果组织病理学评分降低;4.Mof敲除可降低Th17细胞相关因子的表达,包括I117a、I122、RORyt、RORa、Sata3、TGF-β1 和 I1-6,Mof 可与 I117a 和 RORyt 启动子区结合;5.RNA-seq结果发现655个差异表达基因,68个基因(10.4%)与炎症反应调控或免疫性疾病相关,其中47个基因的表达是下调的。结论:1.MOF在DSS诱导的小鼠结肠炎反应中表达逐渐升高,提示MOF参与DSS诱导的小鼠结肠炎反应。2.敲除MOF可改善DSS诱导的小鼠结肠炎的症状。3.敲除MOF可下调Th17细胞功能和分化关键因子的表达而减弱小鼠结肠炎炎症反应。第二部分乳腺癌中组蛋白乙酰转移酶MOF对雌激素受体ERα表达的调控作用研究目的:雌激素受体ERα激活异常是促进乳腺癌发生发展的危险因素,其表达缺失也是内分泌治疗耐药和抵抗的重要原因,ERα蛋白再表达是恢复内分泌治疗敏感性的重要途径。分析MOF和ERα在乳腺癌组织和细胞中的表达相关性,研究MOF对ERα蛋白表达的调控作用机制,为实现ERα蛋白再表达治疗提供新的作用靶点。研究方法:1.乳腺癌组组织和细胞中MOF和ERα之间的表达相关性1.1利用谷歌生物公司的乳腺癌组织芯片,通过免疫组织化学法(IHC)分别检测MOF和ERα在乳腺癌组织中表达情况,并分析两种蛋白在乳腺癌组织中表达水平的相关性;1.2选择ERα表达阳性的乳腺癌细胞系MCF7、T47D和ERα表达阴性的乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 和 HCC1937,Western blotting 检测 MOF 在 ERα 阳性和阴性乳腺癌细胞中的表达差异,在乳腺癌细胞系中确认MOF和ERα的表达相关性;1.3在ERα阳性细胞系MCF7和T47D细胞中,通过脂质体分别转染上调表达MOF 的 pcDNA3.0-Flag-HA-MOF(FH-MOF)及其空白载体(Vector)和敲低MOF 表达的 pGpu6-shMOF 及其对照 pGpu6-shControl,RT-qPCR、Western blotting检测MOF表达变化对ERα表达的影响;1.4分别在无雌激素(E2)刺激和E2刺激的条件下,在MCF7细胞中过表达MOF,Western blotting检测MOF对ERα蛋白的调控作用是否是E2依赖性的;1.5分别通过核质分离实验和细胞免疫荧光实验,检测MOF对E2刺激ERα蛋白细胞核定位改变的影响。2.MOF对ERα转录活性及介导的促乳腺癌细胞增殖能力的影响2.1对照MCF7细胞和MOF过表达MCF7细胞分别用E2 处理 0h、1h,3h和6h,RT-qPCR 检测 MOF 对 E2 刺激 ERα 靶基因(TFF1,CCND1,GREB1)的激活表达影响;2.2用ERα抗体进行ChIP实验,qPCR检测MOF对ERα在靶基因启动子结合能力的影响。2.3分别通过CCK8实验和异种移植瘤实验检测MOF对E2促进MCF7细胞增和体内成瘤能力的影响。3.MOF影响ERα蛋白水平的调控机制3.1在MCF7细胞,用MG132处理对照细胞和MOF过表达细胞,Western Blotting检测MOF对ERα蛋白合成的影响;3.2在MCF7细胞,用CHX处理对照细胞和MOF过表达细胞,Western Blotting检测MOF对ERα蛋白降解的影响;3.3在293T细胞分别转入6×His-ERα和FH-MOF质粒,用CHX处理对照细胞和MOF过表达细胞,Western Blotting验证MOF对ERα蛋白降解的影响;3.4用ERα抗体进行Co-IP实验,Western Blotting检测MOF对ERα蛋白泛素化水平的影响;4.MOF增加ERα蛋白泛素化水平的机制4.1通过对MOF过表达细胞RNA-sequencing结果分析和文献查阅,并通过RT-qPCR和Western Blotting验证,找到MOF影响其表达的E3连接酶Cul4a和Cul4b;4.2通过小干扰RNA siCul4a和siCul4b分别敲低Cul4a和Cul4b的表达,Western Blotting检测对ERα蛋白表达的影响。4.3 Co-IP实验验证Cul4b与ERα蛋白的相互作用以及Cul4b对ERα蛋白泛素化水平的影响;4.4 Co-IP实验验证MOF对Cul4b与ERα蛋白之间相互作用的影响;4.5无E2刺激条件下,用Lys-Ac抗体进行Co-IP实验,Western Blotting检测MOF对HSP90和ERα乙酰化水平影响。4.6无E2刺激条件下,用ERα抗体进行Co-IP实验,Western Blotting检测MOF对HSP90和ERα相互作用的影响;5.MOF对ERα阴性乳腺癌细胞HCC1937细胞中ERα蛋白再表达的影响5.1 用 pGPU6-shMOF 质粒敲低 HCC1937 细胞 MOF 表达,Western Blotting 检测ERα蛋白表达情况;5.2用MOF小分子抑制剂MG149抑制HCC1937细胞中MOF酶活性,Western Blotting检测ERα蛋白表达情况;5.3用MG149和他莫昔芬(TAM)共同处理HCC1937细胞,通过CCK8实验检测MOF对HCC1937细胞TAM抵抗作用的影响。研究结果:1.乳腺癌组织芯片IHC结果分析,MOF与ERα表达呈负相关性;2.在乳腺癌细胞系中分析MOF表达,结果表明MOF在ERα阳性细胞系中低表达,在ERα阳性细胞系中高表达;3.在MCF7和T47D细胞中,分别过表达和敲低MOF后ERα的mRNA水平无显著变化,但过表达MOF可下调ERα蛋白水平,而敲低MOF可上调ERα蛋白水平;4.MG132处理MCF7细胞,结果发现MOF不影响ERα蛋白合成过程;5.CHX处理MCF7细胞,结果表明MOF可加速ERα蛋白的降解过程;6.在293T细胞中验证,MOF可加速ERα蛋白的降解过程;7.Co-IP实验检测ERα蛋白泛素化水平变化,结果发现MOF可增加ERα蛋白泛素化水平;8.MOF可上调Cu14a和Cu14b的表达,但干扰Cu14a表达后对ERα蛋白无明显影响,而干扰Cu14b表达后可上调ERα蛋白表达,并恢复MOF对ERα蛋白的抑制作用;9.Co-IP实验结果发现Cu14b和ERα可相互作用,干扰Cu14b表达后可减少ERα蛋白泛素化水平;10.过表达MOF可增强Cu14b和ERα的相互作用;11.无E2刺激条件下,过表达MOF可增加HSP90的乙酰化水平,并减弱HSP90和ERα相互作用;12.抑制MOF表达后可诱导HCC1937细胞中ERα蛋白再表达;13.MG149抑制HCC1937细胞中MOF酶活性后,ERα蛋白也可再表达;14.MG149和TAM共同处理HCC1937细胞后可恢复HCC1937细胞对TAM的敏感性。结论:1.在乳腺癌组织和细胞中MOF和ERα的蛋白表达水平呈负性相关关系。2.MOF抑制ERα蛋白表达及其介导的促乳腺癌细胞增殖能力。3.MOF通过泛素蛋白酶体途径降低ERα蛋白稳定性。4.MOF上调Cu14b的表达而增加ERα泛素化水平降低其蛋白稳定性。5.无雌激素刺激时,MOF增加HSP90的乙酰化水平使其失去分子伴侣功能引起ERα的降解。6.抑制MOF酶活性可激活ERα阴性乳腺癌细胞中ERα蛋白表达,并提高对他莫西芬的敏感性。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R730.2

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