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《山东大学》 2019年
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Sdccag3及相关非编码RNA对高脂血症大鼠种植体骨整合的影响机制研究

刘飞  
【摘要】:实验目的伴有高脂血症的大鼠植入种植体后,种植体周围的骨整合率明显下降,骨组织的丧失率显著增加,同时伴随骨形成数量明显减少,但是其中的具体调节机制不详。通过测序分析,预测 Sdccag3-miR-193a-3p-lncMSTRG.97162.4/lnc MSTRG.78883.18这两条与成骨相关的调控网络可能参与成骨分化的调控,但是还需后续实验来进一步证明。在本实验研究中,我们将验证Sdccag3及其相关非编码RNAs对成骨分化的影响及作用机制、验证筛选出的两条ceRNA网络是否成立,并计划进一步深入研究该网络调控伴有高脂血症的大鼠在成骨分化中的具体机制。实验方法(1)构建并检测高脂血症大鼠模型,检测动物模型中Sdccag3及其共表达网络中非编码RNA、成骨相关基因的表达;之后在高脂血症大鼠动物模型中抑制miR-193a-3p的表达,检测对高脂血症大鼠种植体周围骨整合的影响及Sdccag3、lnc MSTRG.97162.4、lnc MSTRG.78883.18及成骨相关基因的表达变化。(2)在分子生物学与形态学水平协同检测高脂、普通成骨诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨方向的分化,Runx2、ALP、Sdccag3、miR-193a-3p、lnc MSTRG.97162.4及lnc MSTRG.78883.18的表达变化。过表达或抑制表达miR-193a-3p、沉默lnc MSTRG.97162.4后,结合多种形态学水平观察手段检测BMSCs成骨方向分化能力,并检测BMSCs成骨分化过程中 Sdccag3、lnc MSTRG.97162.4、lnc MSTRG.78883.18、ALP及Runx2基因表达量的变化。(3)通过生物信息学软件预测lnc MSTRG.97162.4和Sdccag3蛋白的靶结合区域,根据筛选结果设计相应探针,并使用RNApull down、Western Blot实验对结合区域进行筛选验证。实验结果(1)高脂组大鼠血清中的脂质水平要明显高于普通组大鼠(P0.05)。(2)与普通组相比,高脂组的,成骨细胞数目较少,骨小梁排列较为紊乱,新骨生成明显减少。(3)用慢病毒载体减低miR-193a-3p表达,种植体周围1mm内的骨组织内lnc MSTRG.78883.18表达无统计学上的差异(P0.05)miR-193a-3p表达水平明显降低,而Runx2、ALP、Sdccag3、lnc MSTRG.97162.4表达量皆明显升高(P0.05)。(4)在高脂肪环境中,BMSCs向成骨细胞分化受到抑制,矿化结节数量少,形成的脂滴数量大。在高脂肪环境中,成骨细胞相关因子Runx2和ALP的表达在BMSCs分化为成骨细胞期间降低。高脂环境下,BMSCs向成骨细胞分化过程中成骨相关因子Runx2及ALP表达减少,从分子层面上说明高脂环境抑制BMSCs成骨分化。高脂环境下,BMSCs向成骨细胞分化过程中Sdccag3、lnc MSTRG.97162.4表达量减少、miR-193a-3p表达量升高,lnc MSTRG.78883.18的表达无明显差异,提示Sdccag3、miR-193a-3p和lnc MSTRG.97162.4表达量会受到高脂环境的影响。(5)miR-193a-3p mimics转染BMSCs后,细胞成骨分化受到抑制,Sdccag3、lnc MSTRG.97162.4表达下调明显,lnc MSTRG.78883.18的表达无明显差异;而miR-193a-3p inhibitor转染 BMSCs 后,细胞成骨分化增强,Sdccag3、lnc MSTRG.97162.4表达上调明显,lnc MSTRG.78883.18的表达无显著差异。说明miR-193a-3p的表达与Sdccag3、lnc MSTRG.97162.4的表达呈负相关。(6)沉默lnc MSTRG.97162.4后,细胞向成骨方向分化受到抑制,Sdccag3表达下降,miR-193a-3p表达上调,而lnc MSTRG.78883.18表达无显著差异。(7)通过RNA pull-down、Western Blot结果综合分析,证实lnc MSTRG.97162.4在361-389序列区可以特异性结合Sdccag3蛋白,从翻译后水平影响Sdccag3蛋白的表达。结论(1)高脂血症可以抑制大鼠纯钛种植体周围的骨形成。(2)MiR-193a-3p可以抑制伴高脂血症的大鼠种植体周围的骨整合。(3)lnc MSTRG.97162.4、Sdccag3可以促进高脂血症大鼠骨整合。(4)lnc MSTRG.97162.4-miR-193a-3p-Sdccag3共表达网络成立,该网络在伴有高脂血症大鼠种植体周围的骨整合中发挥调控的作用。(5)lnc MSTRG.97162.4可以在翻译后水平调节Sdccag3表达。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R783.6

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