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《山东大学》 2018年
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表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)对矽肺性纤维化干预的初步研究

张华  
【摘要】:目的观察不同剂量表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)在不同时间点对染尘大鼠肺脏上皮间质转化(EMT)及其间质纤维化的干预作用,探讨表皮生长因子受体(EGFR)及其信号传导通路在矽肺性纤维化形成过程中的作用机制,为分子靶向药物防治尘肺纤维化提供理论依据。方法建立染尘Wistar大鼠动物模型,随机分为模型组、对照组、高剂量干预组、中剂量干预组、低剂量干预组。高、中、低剂量干预组分别给予不同剂量的EGFR-TKIs灌胃干预(高剂量组13.5mg/d、中剂量组6.75mg/d、低剂量组3.375mg/d)。分别在染尘3d、7d、14d,各组随机取6只大鼠将其安乐死。取材肺组织标本,进行大体肉眼观察和病理学染色,肺部炎症和纤维化半定量评分和肺匀浆羟脯氨酸(Hyp)含量测定,评估肺脏炎症和纤维化程度。免疫组织化学染色(ICH)观察和定量分析肺组织表皮生长因子受体(EGFR)及p-EGFR含量;ELISA方法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中转化生长因-α(TGF-α)含量;RT-PCR方法检测肺组织EGFR、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)mRNA表达水平;Western Blot方法检测肺组织TGF-α、Ras、p-Erk1/2、PI-3KCG、Akt1 蛋白含量。结果1、应用非气管暴露法成功建立Wistar大鼠染尘(矽肺性纤维化)模型染尘不同时间点(3d、7d、14d)检测发现,模型组肺泡炎症评分与对照组相比均显著升高(4.0±0.120vs1.8±0.101,2.1±0.161vs1.0±0.104,1.5±0.135vs 0.5±0.184,均P0.01);肺纤维化评分和羟脯氨酸含量在第7天开始升高,并随时间持续增高,染尘第7天、第14天与对照组比较,肺纤维化评分(1.3±0.164vs 0.7±0.131,3.5±0.263vs0.8±0.086,均P0.01)和羟脯氨酸含量(1.24± 0.931vs 0.59±0.0735,1.49±0.0686vs0.64±0.05 88,P0.01)都有统计学意义。本实验构建的染尘模型肺部炎症和纤维化特征和进展过程符合矽肺性纤维化体内模型特点。2、尘肺纤维化EGFR和EMT及其下游通路ICH肺组织EGFR及p-EGFR表达主要定位于气道上皮细胞和间质细胞的细胞膜或胞浆,模型组各时间点(3d、7d、14d)p-EGFR平均光密度随时间明显增加,与对照组比较有显著性差异(0.2692±0.0312vs0.0613±0.0301,0.5960±0.0641 vs0.0671±0.0348,0.7591±0.0532vs0.0544±0.0613,均P0.01)。ELISA方法检测模型组BALF中TGF-α的含量在染尘第3天明显升高,各时间点(3d、7d、14d)与对照组相比,有显著性差异(69.964±7.92vs34.892±6.248,79.456±9.58vs 36.463 ±6.441,55.764±8.58 vs31.554±8.916,均P0.01)。Western blot检测结果显示,染尘不同时间点(3d、7d、14d)模型组肺组织蛋白TGF-α相对表达量明显上调,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.0 1)。RT-PCR检测显示,模型组EGFRmRNA和间质表达物α-SMA mRNA的表达较对照组均明显上调(P0.01),上皮表达物E-cadherin mRINA表达明显下降,在3d,7d,14d不同时间点差异显著(均P0.01)。上述结果显示EMT与矽肺性纤维化发生、发展过程密切相关,EGFR和TGF-α表达增强,两者结合发挥其生物学效应。Western blot检测结果显示,染尘不同时间点模型组肺组织蛋白Ras、p-Erk1/2、PI-3KCG、Aktl相对表达量均明显上调,与对照组比较(3d、7d、14d),差异有统计学意义(P0.01),提示EGFR下游的EGFR/PI-3K/AKt和Ras/ERK/MAPK通路参与此纤维化过程。3、EGFR-TKIs在矽肺性纤维化过程中的干预作用肺泡炎症评分,染尘第3天,高、中、低剂量干预组和模型相比较,有统计学意义(3.1±0.141vs4.0±0.120,3.3±0.075vs4.0±0.120,3.6±0.259vs s4.0±0.120,均P0.01),且组间比较有统计学意义(P0.05或P0.01)。染尘第7天,高、中、低剂量干预组和模型相比较,有统计学意义(1.2±0.296vs2.1±0.161,1.5±0.213 vs2.1±0.161,1.8±0.316vs2.1±0.161,均P0.05或P0.01),组间比较有统计学意义(P0.05或P0.01)。染尘第3天、第7天随着干预剂量的增加,肺泡炎症明显减轻,高剂量干预组作用最明显。染尘第7天和第14天,与模型相比较,高、中、低剂量干预组随着干预剂量的增加,肺切片纤维化评分的增高明显下调,差异有统计学意义(7d:1.4±0.189 vs1.3±0.164,1.6±0.179vs1.3±0.164,1.7±0.250 vs1.3±0.164,均P0.01;14d:2.4±0.101vs3.5±0.263,2.7±0.208 vs3.5±0.263,2.9±0.154 vs3.5±0.263,均P0.01)。在染尘第7天,高剂量和低剂量干预组(1.4±0.189vs1.7±0.250)比较,高剂量和中剂量干预组间比较(1.4±0.189vs1.6±0.179),有统计学意义(P0.01)。在染尘第14天,高剂量和低剂量干预组比较(2.4±0.101vs2.9±0.154,P0.01),高剂量和中剂量干预组间比较(2.4±0.101 vs2.7±0.208,P0.05),有统计学意义。羟脯氨酸的含量高、中、低干预组各时间点(7d,14d)与模型组相比较均降低,差异显著有统计学意义(7d:0.81±0.0955vs1.24±0.931,0.92±0.0833vs 1.24±0.931,1.10±0.0759vs1.24±0.931;14d:0.90±0.7350vs1.49±0.0686,1.09±0.0612 vs1.49±0.0686,1.30±0.0637vs1.49±0.0686;P0.05 或 P0.01)。在 7d、14d 时间点干预组间比较:高剂量干预组和低剂量干预组比较,差异有统计学意义(0.81±0.0955vs 1.10±0.0759,0.90±0.735vs1.30±0.0637,均P0.01);高剂量干预组和中剂量干预组比较,差异具有统计学意义(0.81±0.0955vs0.92±0.0833,0.90±0.735 vs1.09±0.0612,P0.05或P0.01);中剂量干预组和低剂量干预组比较,差异具有统计学意义(0.92±0.0833vs1.10±0.0759,1.09±0.0612 vs 1.30±0.0637,均P0.01)。总之,在染尘第7天,第14天,纤维化指标肺羟脯氨酸的含量随EGFR-TKIs干预剂量的增加而降低,干预可减轻其纤维化发展,高剂量干预组作用最明显。对于染尘肺纤维化EMT过程EGFR-TKIs的干预效果,RT-PCR检测肺组织α-SMA mRNA结果显示其上调表达干预减缓。高、中、低剂量干预组分别在染尘3d、7d、14d时间点和模型组比较,差异都具有统计学意义(P0.01)。在染尘第3天,第7天,第14天干预组间比较,高剂量干预组和低剂量干预组比较,都有统计学意义(均P0.01);高剂量干预组和中剂量干预组比较,染尘第3天有差异(P0.01),染尘第7天和第14天差异不明显(P0.05);中剂量和低剂量干预组比较,都具有统计学意义(P0.05或P0.01)。RT-PCR检测肺组织E-cadherin mRNA,结果显示可使其下降的表达减缓。染尘第3天,第7天,高、中剂量干预组分别和模型组,差异具有统计学意义(P0.0 1);低剂量干预组与模型组比较,差异不显著(P0.05);染尘第14天,高、中、低剂量干预组分别同模型组比较,差异具有统计学意义(P0.01)。干预组间比较,在染尘第3天,第7天,第14天,高剂量干预组和中剂量干预组比较,差异不明显(P0.05)。以上结果显示,随着EGFR-TKIs干预剂量的增加,EMT过程,即肺组织α-SMAmRNA上升和E-cadherin mRNA下降的表达干预减缓,高剂量干预组和中剂量干预组作用最明显。EGFR-TKIs干预后,ICH肺组织p-EGFR平均积分光密度和RT-PCR检测EGFRmRNA增高的表达均显著受抑,与模型组相比较,各时间点(3d,7d,14d)高、中、低干预组都有显著性差异(均P0.01)。高、中、低干预组组间在染尘3d、7d、14d时间点比较,高剂量干预组和低剂量干预组比较,有统计学意义(0.1]04± 0.0211vs0.20]5±0.0494,0.3207±0.0290 vs 0.4113 ±0.0316,0.4019±0.0307 vs0.5329±0.0465,均P0.01);中剂量干预组与低剂量干预组比较,都有统计学差异(均P0.05);而高剂量干预组和中剂量干预组比较,仅在3d、14d 时间点有统计学意义(0.1104±0.021 1vs 0.1558 ±0.0334,0.4019±0.0307vs0.4635 ±0.0322,均P0.05),染尘第7天差异没有统计学意义(P0.05)。EGFRmRNA在染尘第3天,第7天,第]4天,各干预剂量组间比较,差异均具有统计学意义(均P0.01)。随着EGFR-TKIs干预剂量的增加,肺组织p-EGFR平均积分光密度和EGFRmRNA增高的表达均显著受抑,高剂量干预组和中剂量干预组作用最明显。经EGFR-TKIs的干预后,干预组各时间点的BALF中TGF-α浓度均低于模型组,高剂量干预组在染尘3d、7d、14d时间点与模型组相比较,差异显著具有统计学意义(46.204±4.395 vs69.964±7.92,54.1 99±5.492vs79.456±9.58,34.017±9.3911vs 55.764±8.58,均P0.01);中剂量干预组在3d、7d、14d时间点与模型组相比较,差异显著具有统计学意义(均P0.01);低剂量干预组和模型组比较,没有统计学意义(P0.05)。高、中剂量干预组间比较,在3d、7d、14d时间点没有统计学意义(P0.05)。和模型组比较,干预各组TGF-α蛋白相对表达水平上调数值下降,染尘第3天、第7天、第14天,高、中、低剂量干预组分别和模型组比较,差异具有统计学意义(P0.01)。不同剂量干预组间比较,在染尘第3天,第7天,第14天,高剂量干预组和低剂量干预组比较,都有统计学意义(均P0.01);高剂量干预组和中剂量干预组比较,TGF-α相对表达水平差异无统计学意义(P0.05);中剂量和低剂量干预组比较差异都具有统计学意义(均P0.01)。随着EGFR-TKIs干预剂量的增加,高、中、低剂量干预组BALF中TGF-α浓度和肺组织TGF-α蛋白相对表达上升明显减缓,高剂量和中剂量干预组作用最明显。经EGFR-TKIs干预后,Ras蛋白相对表达水平的上升下调,高、中剂量干预组分别在染尘3d、7d、14d时间点和模型组比较,差异具有统计学意义(P0.01),低剂量干预组和模型组比较,差异不显著(P0.05)。各时间点(3d,7d,14d)高剂量和中剂量组组间比较未见明显统计学意义(P0.05)。干预后p-Erk1/2蛋白相对表达水平下调,高、中、低剂量干预组分别在3d、7d、14d时间点和模型组比较,差异具有统计学意义(P0.05或P0.01)。不同剂量干预组间比较,在染尘第3天、第7天、第14天,高剂量干预组和低剂量干预组比较,都有统计学意义(均P0.01);中剂量和低剂量干预组比较,差异都具有统计学意义(均P0.05);高剂量干预组和中剂量干预组比较,p-Erk1/2相对表达水平差异无统计学意义(P0.05)。高、中、低剂量干预组随着EGFR-TKIs干预剂量的增加,肺组织Ras和TGF-α蛋白相对表达上升明显减缓,高剂量和中剂量干预组作用最明显。经EGFR-TKIs干预后,PI-3KCG相对表达的上升水平下调,与模型组相比较,低剂量干预组在染尘3d、7d、14d时间点没有统计学意义(P0.05);中剂量干预组分别在染尘第7天、第14天的下调具有统计学意义(P0.05)。高剂量干预组在第3天、第7天、第14天下调都具有统计学意义(P0.05或P0.01)。剂量干预组的组间比较,染尘第7天、第14天,高剂量组相对于中剂量组PI-3KCG相对表达上升水平下调不显著,没有统计学意义(P0.05)。高剂量和中剂量干预组作用最明显。干预后,Akt1相对表达上升的水平下调,高、中、低剂量干预组分别在染尘3d、7d、14d时间点与模型组相比较,下调都具有统计学意义(P0.01)。剂量干预组间比较,在染尘第3天、第7天、第14天,高剂量干预组和低剂量干预组比较,都有统计学意义(P0.001);中剂量和低剂量干预组比较,差异都具有统计学意义(P0.01或P0.05);高剂量干预组和中剂量干预组比较,差异有统计学意义(P0.05)。高剂量干预组作用最明显。以上结果提示EGFR-TKIs干预后,EGFR与配体TGF-α活化减轻,可抑制下游信号转导通路EGFR/PI-3K/AKt和Ras/ERK/MAPK的靶点蛋白Ras、p-Erk1/2、PI3K、Akt1,从而减少了矽尘肺组织损伤诱导的EMT,减轻肺纤维化的改变。这一过程与剂量有关,高剂量和中剂量干预组作用明显。结论实验结果证实矽肺性纤维化的形成发生与EMT有关,与EGFR、TGF-α、Ras、p-Erk1/2、PI3K、Akt1 关系密切。EGFR-TKIs 干预可减少与配体 TGF-α结合,抑制二氧化硅损伤所导致的EGFR的过度活化,从而阻遏下游信号转导通路靶点蛋白Ras、p-Erk1/2和PI-3KCG、Akt1的激活,减轻肺组织损伤诱导的EMT,减轻肺纤维化。此干预过程中与剂量有关,高剂量和中剂量干预组作用明显。EGFR和Ras/ERK/MAPK和PI-3K/AKt信号转导通路的靶点蛋白在矽肺性纤维化发病机制中都存在关联。研究提示通过干预EGFR-TKIs靶点抑制EGFR活化,进而延缓矽肺肺纤维化的EMT发生,可减轻病情发生及进展,为矽肺性纤维化的防治策略开拓新的思路。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R135.2;R575.2

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