全氟辛酸和全氟辛烷磺酸诱发小鼠肝肿大、氧化应激及相关效应的研究

【摘要】：由于全氟类化合物(PFCs)的热稳定性、化学稳定性和表面活性等性质,使其被广泛应用于各种工业过程和产品中,例如防水和防油剂、消防泡沫、润滑剂、表面活性剂和涂料等。在所有的PFCs中,最常用且最典型的是全氟辛酸(PFOA)和全氟辛烷磺酸(PFOS)。由于碳氟键(C-F)十分稳定,PFOA和PFOS难以被自然转化和降解,导致它们在环境和人体中具有持久性。PFOA和PFOS的广泛使用引起了人们对其毒性作用和人类健康风险的关注,并且沿着食物链的蓄积,PFOA和PFOS的毒性可能会被放大。PFOA和PFOS进入人体后,经血液循环系统分布到全身各器官,并引发多种机体损伤。肝脏是人体最重要的解毒器官,与多种疾病的发生与发展密切相关,同时也是PFOA和PFOS主要的毒性靶器官,研究表明,PFOA和PFOS暴露可以造成小鼠肝肿大症状。此外,氧化应激效应可以在很多组织中发生,大部分机体损伤的发生与其密切相关,PFOA和PFOS可以在机体内诱发氧化应激,甚至进一步导致细胞死亡,严重时产生组织损伤。目前,PFOA和PFOS诱发的小鼠肝肿大效应与氧化应激效应之间的相关关系尚未可知;此外,PFOA和PFOS在亚细胞水平上由氧化应激引起细胞凋亡通路的研究较少;PFOA和PFOS与抗氧化酶结合的分子机制尚不明确;动物、细胞、亚细胞和分子水平上都可以评价污染物的毒性效应,以往的研究往往只注重其中某一个水平,忽略了多个水平的相互结合。针对以上问题,本研究以环境毒理学、现代仪器分析科学为背景,从动物、细胞、亚细胞和分子水平上对PFOA和PFOS诱发小鼠肝肿大及氧化应激等相关毒性效应与具体毒性机制进行了研究。首先,对PFCs的特点、污染情况以及PFOA和PFOS引起的各系统的毒性效应进行了概述,介绍了 PFOA和PFOS在各生物体内诱发的氧化应激效应以及调控细胞凋亡的作用机制,总结了 PFOA和PFOS与生物大分子的相互作用。通过对现有研究的综述,归纳了 PFOA和PFOS毒性领域的最新研究进展,提出了目前的研究仍没有解决的问题,介绍了本研究的主要内容及意义。在动物水平上,以C57BL/6小鼠为研究对象,研究了 PFOA和PFOS诱发的小鼠肝肿大及氧化应激等相关毒性效应与机理,探究了氧化应激与肝肿大之间的相关关系。小鼠经添加或不添加N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)的PFOA或PFOS进行为期21天暴露后,检测了小鼠肝肿大的情况,并对各组小鼠的肝脏进行组织病理观察,分析病理损伤。利用透射电镜观察小鼠肝脏的超微结构的损伤,并且检测了小鼠肝脏内过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及脂质过氧化水平(丙二醛MDA含量)的变化。研究结果显示,经PFOA和PFOS暴露后,小鼠肝脏明显肿大、肝体指数显著增加,但添加NAC组的小鼠肝肿大症状较轻,说明氧化应激效应越强,肝肿大症状越严重。肝脏组织病理切片结果显示PFOA和PFOS都会导致小鼠肝细胞水肿、炎性细胞浸润、空泡变性以及细胞核增大等病理现象,透射电镜观察小鼠肝细胞超微结构发现PFOA和PFOS导致肝细胞线粒体肿胀、空泡化,核糖体从内质网上脱落等病理现象,而NAC可以缓解小鼠肝细胞线粒体受到的损伤,从而使肝肿大症状减轻。此外,PFOA和PFOS暴露都会破坏小鼠肝脏的氧化还原平衡,改变抗氧化酶CAT和SOD的活性,产生脂质过氧化,从而诱发氧化应激效应,造成组织的氧化损伤。而NAC可以清除机体内过多的ROS,从而缓解PFOA和PFOS对小鼠的肝肿大、氧化损伤等毒性效应。在细胞和亚细胞水平上,研究对象为正常小鼠的原代肝细胞,细胞在体外暴露于PFOA和PFOS后,评价并分析了在小鼠原代肝细胞内PFOA和PFOS导致的氧化应激、细胞凋亡等相关毒性效应与机理。对小鼠原代肝细胞暴露PFOA或PFOS24h后,测定了细胞活力,检测了细胞内ROS的含量以及抗氧化酶CAT、SOD的活性和GSH的含量,细胞膜损伤情况,线粒体膜电位变化,细胞内Ca2+浓度,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的活化情况,以及细胞凋亡的比例。研究结果证明经24 h PFOA和PFOS暴露后,过量ROS积累在小鼠原代肝细胞内,CAT和SOD的活性被改变,说明PFOA和PFOS削弱了细胞内的抗氧化能力,破坏了氧化还原平衡,从而诱发了氧化应激,对小鼠肝细胞产生了毒性效应。PFOA和PFOS还破坏了细胞膜,改变了细胞膜的通透性,降低了肝细胞内的线粒体膜电位,并进一步激活了细胞内Ca2+和caspase-3的活性,最终诱发了细胞凋亡。研究结果说明氧化应激调控参与了 PFOA和PFOS诱发的小鼠原代肝细胞的凋亡,并且证明了 PFOA和PFOS诱导的细胞凋亡的途径由线粒体介导。在分子水平上,首先以间接抗氧化酶溶菌酶(LYZ)为研究对象,利用多种光谱学(荧光发射光谱、同步荧光光谱、紫外-可见光谱、圆二色谱、共振光散射光谱、三维荧光光谱)方法研究了 PFOA和PFOS对LYZ的结构和构象的影响;探究了 PFOA和PFOS对LYZ功能的影响;利用分子对接技术模拟了 PFOA、PFOS与LYZ的结合位点,建立了 PFOA-LYZ和PFOS-LYZ作用模型。研究结果显示,LYZ与PFOA、PFOS结合并发生作用,导致LYZ分子的酶活性下降。LYZ的芳香族氨基酸微环境和二级结构被PFOA和PFOS改变,LYZ分子发生去折叠现象。PFOA、PFOS与LYZ结合后生成了新的配合物,使体系的粒径增大。PFOA和PFOS与LYZ的结合位点都位于LYZ的活性中心附近,且结合位点中均包括色氨酸(Trp 63和Trp 108)。同时由于PFOS的磺酸基团的高极性,使得PFOS可以和Asp 52直接以氢键结合,导致PFOS对LYZ的活性影响更大。在分子水平上,除间接抗氧化酶以外,还以直接抗氧化酶CAT和SOD为研究对象,利用多种光谱学技术(荧光发射光谱、同步荧光光谱、紫外-可见光谱、圆二色谱、共振光散射光谱)、酶活性检测、等温滴定量热和分子对接等方法研究了 PFOA、PFOS对CAT和SOD结构和功能的影响。利用多种光谱法探究了PFOA和PFOS对两种酶结构和构象的影响;检测了与PFOA、PFOS结合后,CAT和SOD酶活性的变化;利用分子对接技术模拟了 PFOA和PFOS在酶上的结合位点;利用等温滴定量热技术探究了 PFOA、PFOS与SOD相互结合的热力学参数、结合常数等。(1)PFOA和PFOS与CAT的相互作用改变了 CAT的结构。结果表明,PFOA和PFOS均通过降低α螺旋和增加β折叠含量影响CAT的二级结构。PFOA可以使CAT的骨架松弛和展开,但是PFOS对CAT骨架影响不大,却对CAT的芳香族氨基酸和血红素基团周围的微环境有影响。PFOA和PFOS暴露导致CAT的粒径减小,且PFOS对CAT粒径的影响更大。由于PFOA不会优先结合在CAT的活性中心,因此当CAT与PFOA结合时,CAT的活性没有明显变化,但是当PFOS与CAT相互作用后,CAT的酶活性最终下降到71.81%。分子模拟结果显示PFOA在CAT上的结合位点在酶的表面,而PFOS的结合位点靠近CAT的活性中心,并且与酶活性有关的两个重要氨基酸残基位于PFOS的结合位点,因此PFOS比PFOA对CAT的酶活性影响更大。(2)PFOA和PFOS与SOD结合后使SOD的酶活性上升。PFOA和PFOS与SOD的结合常数分别为1.68±0.13和1.13±0.32(105M-1),相互作用过程都是自发进行的。PFOS可以和Tyr残基结合,并影响Tyr的微环境,但PFOA对Tyr的影响不明显。PFOA可以使SOD的骨架变松散,发生去折叠现象,但PFOS却使SOD的骨架变紧。PFOA和PFOS也会改变SOD的二级结构,使α螺旋、β折叠、转角和无规则卷曲的百分含量发生变化。此外,PFOA和PFOS都可以和SOD形成配合物,使粒径增大,但随着PFOS浓度的进一步增加,会使PFOS-SOD配合物的粒径变小。分子对接的结果表明PFOA和PFOS可能是通过改变SOD的结构增大了酶分子活性中心附近的口袋,从而使SOD可以更充分地和反应底物接触,导致了酶活性上升。最后,对本论文的主要结论和创新点进行了归纳和总结,分析了本研究的不足之处,并对该研究领域的研究方向进行了展望。本研究建立了多层面的综合毒性评价方法,包括动物、细胞、亚细胞和分子四个层面,评价了 PFOA和PFOS诱导的小鼠肝肿大及氧化应激等相关毒性效应与机理。该研究证明了PFOA和PFOS破坏小鼠肝脏的抗氧化防御系统诱发氧化应激,并造成肝肿大、组织和超微结构损伤,氧化应激效应越强,肝肿大症状越严重,而抗氧化剂可以明显缓解PFOA和PFOS对小鼠的肝肿大、氧化损伤等毒性效应,因此可以通过抑制氧化应激效应对肝损伤进行治疗;揭示了 PFOA和PFOS在小鼠原代肝细胞内通过破坏抗氧化防御系统,使过多的ROS积累,从而诱发氧化应激效应,并进一步由线粒体介导造成细胞凋亡;建立了 PFOA、PFOS与LYZ、CAT、SOD这三种抗氧化酶之间的结合模型,分析了 PFOA和PFOS影响蛋白结构和功能的具体机制,证实了 PFOA和PFOS可以和LYZ、CAT、SOD结合并对酶结构产生影响,改变酶活性,使酶无法正常发挥其功能。动物、细胞、亚细胞和分子四个层面上的研究综合并全面地评价了 PFOA和PFOS诱发的小鼠肝肿大与氧化应激等相关毒性效应,为PFOA和PFOS导致肝损伤的的致病机理以及最大限度地降低PFOA和PFOS的毒性效应提供了参考;为评估PFCs的毒性、为治疗相关毒性物质造成的疾病提供了科学的参考依据。