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SHOC2促进乳腺癌进展及调控乳腺癌mTOR抑制剂敏感性的机制研究

耿文文  
【摘要】:研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,它的发病是涉及癌基因和抑癌基因的表达失调及通路异常激活的多步骤过程。乳腺癌的治疗除手术外,化疗、内分泌治疗和靶向治疗是乳腺癌治疗的重要手段。在乳腺癌的靶向治疗中,mTOR抑制剂依维莫司在各种临床试验中均显示出有效的结果,并已被批准可以与甾体芳香化酶抑制剂依西美坦联合用于非甾体类芳香酶抑制剂(例如来曲唑或阿那曲唑)治疗失败的、激素受体阳性、HER-2阴性的晚期乳腺癌患者。尽管依维莫司在乳腺癌中的治疗应用中具有相当大的潜力,但也与一些关键问题如耐药性有关,这些问题最终可能会限制其效果并导致治疗失败。其中,旁路信号传导途径的反馈激活效应是mTOR抑制剂耐药重要原因之一,可以影响和诱导依维莫司耐药。Ras-Raf-ERK通路的异常激活是启动肿瘤发生发展转移的关键步骤,ERK通路的激活过程首先是细胞外刺激信号使GTP结合至Ras,然后Raf被招募至GTP-Ras并被激活,Raf活化后激活MAPK(MEK1/2),最终MEK1/2磷酸化激活ERK1/2。然而,在ERK通路控制的广泛的生物学反应中,如何调控信号的特异性尚不十分清楚。研究显示,支架蛋白可以促进ERK通路核心信号因子间的相互作用和功能,在控制ERK1/2活性方面发挥着不可或缺的作用,而支架蛋白家族成员SHOC2支架蛋白可以正性调控Ras通路,在多种肿瘤细胞中通过激活Ras-Raf-ERK通路,促进了肿瘤的发生发展。SHOC2还可以通过调节微丝微管重构、促进细胞异常增殖并抑制凋亡来增强肿瘤细胞的恶性潜能,促进肿瘤的进展及诱导耐药。因此,作为Raf-ERK通路的关键调节因子,SHOC2可能在乳腺癌细胞依维莫司耐药机制中发挥着重要的作用。本论文分析了支架蛋白SHOC2在乳腺癌发生、发展中的作用及对乳腺癌患者预后的影响,并初步研究SHOC2介导Raf-ERK通路在乳腺癌mTOR通路抑制剂依维莫司耐药机制中的调控作用,为乳腺癌靶向治疗的深入研究奠定了理论和实验基础。第一部分SHOC2表达与乳腺癌患者病理参数和预后的相关性及对乳腺癌细胞增殖、凋亡和Ras通路的调控研究目的:通过检测SHOC2基因及蛋白在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达,并分析与乳腺癌患者的临床病理参数之间的关系,初步探讨了 SHOC2在乳腺癌中表达的临床意义;通过体外实验研究SHOC2表达对于乳腺癌细胞增殖、周期、凋亡及Ras通路的调控作用。研究方法:应用qRT-PCR、Western Blotting分别检测11例乳腺癌组织及匹配癌旁组织中SHOC2的mRNA和蛋白的表达水平的表达水平,免疫组织化学染色方法进一步检测了 120例乳腺癌组织和匹配癌旁组织中SHOC2蛋白的表达水平,回顾性分析SHOC2蛋白的表达与患者临床病理参数之间的相关性,及对于乳腺癌患者预后的意义。在体外实验中,通过敲低及过表达SHOC2,运用MTT、流式细胞及Western Blotting分别检测SHOC2对于乳腺癌细胞增殖、周期、凋亡及Ras通路的调控作用。研究结果:1.qRT-PCR、Western Blotting及免疫组织化学染色结果均显示SHOC2的基因和蛋白表达水平在乳腺癌组织中较癌旁乳腺组织均有明显升高(P0.01)。2.乳腺癌组织中SHOC2蛋白的高表达与乳腺癌患者的组织学分级(P0.001)、肿瘤大小(P=0.023)、ER状态(P=0.028)密切相关,而与性别、年龄、PR、HER2状态和淋巴结转移状态无关。生存分析表明,SHOC2蛋白高表达可以显著降低乳腺癌患者的总生存率(P0.001),并且对于ER阴性的乳腺癌患者影响更为明显。对于影响乳腺癌预后的因素行单因素及多因素分析结果显示,SHOC2的表达水平是乳腺癌患者预后的独立影响因子。3.体外实验结果证明SHOC2敲低之后,抑制乳腺癌细胞的增殖能力明显受到抑制(P0.001);而S期乳腺癌细胞比例明显降低(P0.001)并促进细胞的凋亡(P0.001),这可能是乳腺癌细胞增殖抑制的重要原因。另外,通路Western Blotting实验结果显示,SHOC2敲低可以显著抑制乳腺癌细胞Ras通路的激活,而过表达SHOC2可以激活Ras通路,促进细胞增殖。研究结论:1.SHOC2在乳腺癌的发生过程中发挥重要作用,并影响乳腺癌患者的预后。2.SHOC2表达水平可以可影响乳腺癌细胞的增殖与凋亡,并且可能是通过Ras通路调控。第二部分SHOC2介导的Raf-1-ERK通路活化在乳腺癌细胞mTOR抑制剂依维莫司耐药中的作用研究目的:研究SHOC2蛋白在乳腺癌细胞mTOR抑制剂依维莫司耐药中的作用,同时研究其作用的具体机制。研究方法:应用CCK-8细胞增殖实验检测不同乳腺癌细胞株对于依维莫司的药物敏感性,初步筛选依维莫司耐药的细胞细胞系,流式细胞技术检测依维莫司对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231及Hs578T周期的影响。用Western Blotting方法检测依维莫司处理后乳腺癌细胞系内mTOR通路及Raf-1-ERK通路的变化以及敲低SHOC2后对于Raf-1-ERK通路的影响,运用免疫共沉淀实验研究SHOC2蛋白与Raf-1之间是否存在相互作用及变化趋势。依维莫司联合使用Raf-1-ERK通路抑制剂PD98059,Western Blotting检测细胞通路的变化,CCK-8细胞增殖实验检测检测细胞增殖变化,流式细胞技术检测乳腺细胞周期变化。研究结果:1.Luminal A型乳腺癌细胞系T47D、MCF-7及三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、Hs578T对mTOR抑制剂依维莫司相对耐药,IC50均大于100 nM.Her2阳性乳腺癌细胞系BT474对依维莫司相对敏感,IC50小于100 nM。结合第一部分结果,我们选择三阴性乳腺癌细胞系进行进一步的实验研究。2.mTOR抑制剂依维莫司作用于耐药的MDA-MB-231,Hs578T三阴性乳腺癌细胞系的实验中,依维莫司分别以浓度梯度和时间梯度作用MDA-MB-231,Hs578T三阴性乳腺癌细胞的Western Blotting结果显示,Raf-1(S338)磷酸化表达逐渐增多,下游的ERK表达逐渐上调,Raf-1-ERK通路被反馈激活。对其通路活化的机制进行研究,免疫共沉淀结果显示SHOC2与Raf-1结合明显增强,促进了 Raf-1的磷酸化活化及下游ERK通路的活化。3.敲低SHOC2可以明显抑制mTOR抑制剂依维莫反馈激活的Raf-1-ERK通路。依维莫司作用乳腺癌细胞后,p-mTOR表达受到抑制,稳定敲低组SHOC2表达明显降低,依维莫司作用于对照组及空转染组后Raf-1-ERK通路被激活,p-Raf-1(S338)表达上调,p-ERK表达也随之升高,而SHOC2+依维莫司组,p-Raf-1(S338)及p-ERK表达均明显下调,说明SHOC2敲低可显著抑制依维莫司引起的Raf-1-ERK。4.Western Blotting结果显示Raf-1-ERK通路MEK1抑制剂PD98059可以显著抑制Raf-1-ERK及反馈激活的Raf-1-ERK通路,p-ERK表达明显降低。CCK8细胞增殖实验及流式细胞周期结果显示抑制剂抑制反馈激活的Raf-1-ERK通路可以增强MDA-MB-231,Hs578T三阴性乳腺癌细胞对于mTOR抑制剂依维莫司的敏感性,抑制剂联合依维莫司组细胞增值能力较其他各组明显减弱(P0.001),细胞周期阻滞于G0/G1期,S期细胞比例明显降低(P0.001)。研究结论:1.SHOC2作为Raf-ERK通路的调节蛋白,可以通过增强与Raf-1的结合促进Raf-1的磷酸化活化,参与了依维莫司耐药乳腺癌细胞内反馈通路Raf-1-ERK通路的激活;2.通过抑制反馈激活的Raf-1-ERK通路,可以增加乳腺癌细胞对于依维莫司的敏感性,所以SHOC2介导的Raf-1-ERK通路反馈激活机制有可能是乳腺癌细胞依维莫司耐药的重要机制。第三部分敲低SHOC2对于改善乳腺癌细胞对于mTOR抑制剂依维莫司敏感性的研究研究目的:体外实验检测SHOC2蛋白对于乳腺癌细胞依维莫司敏感性的影响,体内实验进一步验证敲低SHOC2之后裸鼠成瘤对于依维莫司敏感性。研究方法:运用RNAi方法特异性地抑制SHOC2基因及其蛋白的表达,体外细胞CCK-8实验、平板克隆形成实验、流式细胞实验检测SHOC2蛋白敲低联合依维莫司之后,细胞增殖能力、细胞周期及凋亡的变化。裸鼠成瘤实验检测SHOC2蛋白敲低之后裸鼠成瘤对于依维莫司的敏感性。研究结果:1.在MDA-MB-231、Hs578T三阴性乳腺癌中,敲低SHOC2联合mTOR抑制剂依维莫司组细胞的增殖能力及克隆形成能力较其对照组、空转染组、SHOC2敲低组及依维莫司单药组明显受到抑制,敲低SHOC2可以显著增强依维莫司抑制细胞增殖(P0.001)及克隆形成(P0.001)的能力;2.在MDA-MB-231、Hs578T三阴性乳腺癌中,流式周期实验结果显示敲低SHOC2联合mTOR抑制剂依维莫司组细胞较其他各组S期比例明显降低,流式凋亡实验显示联合组凋亡比例明显升高,Western Blotting结果显示,联合组周期特异性蛋白Cyclin D1表达明显下调,抑制凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax、Ceaved-caspase 3表达升高。这说明,敲低SHOC2联合mTOR抑制剂依维莫司可以显著抑制乳腺癌细胞进入S期(P0.001),并促进细胞凋亡(P0.001);3.裸鼠成瘤实验中,结果显示敲低SHOC2联合依维莫司组裸鼠成瘤较其他组明显减小(P0.001),对于裸鼠肿瘤组织的Western Blotting结果显示,SHOC2敲低可明显抑制反馈激活的Raf-1-ERK通路。所以,SHOC2敲低抑制反馈激活的Raf-1-ERK通路可增强裸鼠皮下移植瘤对于依维莫司敏感性,抑制裸鼠种瘤生长。研究结论:1.体外实验中,敲低SHOC2可以增强mTOR抑制剂依维莫司对于细胞增殖的抑制作用以及增强mTOR抑制剂依维莫司对于乳腺癌细胞周期阻滞效应和促细胞凋亡作用;2.体内实验中,敲低SHOC2可以增强依维莫司对于裸鼠皮下成瘤的抑制。


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