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《山东大学》 2005年
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干扰素诱导蛋白200家族生物学功能的研究

于瑾  
【摘要】:干扰素是一类具有调节细胞生长和分化、免疫反应、抗肿瘤及抗病毒等众多生物学功能的小分子蛋白质,已被广泛的应用于预防和治疗病毒感染等多种临床疾病。它的众多生物学功能是通过一系列干扰素诱导蛋白来实现的。p200蛋白家族是干扰素诱导产生的众多蛋白质中的一类。该类蛋白结构上具有高度的相似性,主要包括4个鼠类家族成员,p202、p203、p204、p205和3个人类蛋白成员,IFI16、MNDA和AIM-2。它们结构上的共同特点是至少有一个由200个氨基酸组成的保守序列,存在于a或者b片段。大部分的200家族蛋白成员还有一个与干扰素反应和细胞凋亡相关的结构域(DAPIN)/PYRIN,与细胞凋亡和免疫反应信号途径的调节过程中蛋白质之间相互作用密切相关。已有的研究揭示200家族蛋白在细胞周期调节和分化中起重要作用,通过影响调节多种转录因子如抑瘤蛋白p53和pRb来实现,而且有研究显示200家族基因在染色体上的突变与癌症发生有关。 一、鼠类蛋白成员p204生物学功能的研究 本论文研究内容主要集中在IFI200家族中的鼠类蛋白成员p204和其对应的人类蛋白成员IFI16。p204基因是耶鲁大学的Lengyel教授的实验室首先发现并克隆的。p204蛋白有640个氨基酸,含有两个保守的200个氨基酸模序,分别位于a片段和b片段,表观分子量为72kDa,在其氨基端含有核定位信号(NLS)和核输出信号(NES),通过与相应的蛋白质相互作用发挥调节肌细胞分化。p204过度表达具有抑制细胞生长的功能,可以延缓细胞由GO/Gl期进入S期。研究发现p204 Jj,匀;少、」训心卜’j,‘卜,_:企)〔 这种抑制细胞生长的功能可以通过结合核糖体!〕NA特异性土游结合因J二(阴l:)进 而引起r尺NA的转录抑制来实现的。另一方面,p20」蛋白的氨基酸序列中含有!x(:xli 模序,该模序是与Rb蛋白结合的特征序列,pZo4蛋白可以通过这个特征序列与pl{b 蛋白结合,参与抑制细胞增殖的功能。 P2以蛋白在动物多种器官组织中都有表达,如胸腺、骨、骨髓、脾、心脏和 骨骼肌。本实验室早期所作的研究工作提示P204在肌分化中起重要作用。在成肌 细胞CZclZ中,pZo4过度表达有效的促进成肌细胞向肌管分化。在这个过程中, pZO4蛋白磷酸化,由胞核移至胞质中,通过蛋白质之间相互作用影响重要的肌分 化调节因子MyoD、Id蛋白等。虽然对于p204的在肌分化中的调节作用己有一定 了解,但对于它在生物发育中的其他生物学功能尚知之甚少。最近的研究发现, P204相互作用蛋白pRb在成骨细胞分化过程中通过CBFAI起调节作用。为了探讨 p204是否参与骨发生及成骨细胞的分化,本论文系统的研究了p204调节成骨细胞 分化的可能性,结果揭示p204在骨骼分化中亦扮演着重要角色,并且阐明了相应 的分子机制,即其与重要的骨发生调节因子BMP一2、Smad和CBFAI相互作用而 发挥协同调节因子的功能。 1.我们通过免疫蛋白印迹实验首先证实了p204蛋白在内源性骨骼组织 中显著表达;免疫组织化学染色结果显示P204蛋白在胚胎成骨细胞 中表达,并且位于成骨细胞核内。pZO4在分化中的软骨细胞中表达, 而在处于静止阶段和增生阶段的软骨细胞中不表达,提示P204作为 核蛋白有可能在调节骨骼成熟分化中起作用。 2.通过RT一PCR和免疫蛋白印迹方法发现在BMP一2诱导的多能分化间 充质细胞cZC12向成骨细胞分化的过程中,p204无论在转录水平还 是蛋白水平都增加。提示p204蛋白在成骨细胞分化的过程中扮演着 重要角色。 3.通过对PZo4基因核酸序列的分析,发现其转录调控区有5个潜在的 Smad结合位点,Smed是成骨细胞分化中的重要调节因子,它通过传 递BMP信使而发挥调节骨发生的作用。这个发现促使我们研究是否 smad结合元件(SBEs)参一与了成骨细胞分化过程中P204水平的升高。 我们使用了两个p2()4特异性报告基因系统20通一25即一ILlc和2训一 尔,、‘’。州.Ji{一学f介_沦文 SSBE一hJC,分别将11了!2()4基因5’端侧翼)je列的一1578一一l3Zq摹 因片段(含有2个sB卜S)和一1578一+38基因片段(含有5个SBEs) 插入p队3质粒中荧光素酶基因的上游。共转染仁述报告基因与 Smadl、4、5的真核表达质粒,通过检测荧光素酶表达活性研究Slnad 对‘于pZO4表达的影响。结果显示,报告基因质粒转染到C2C12细胞 后荧光素酶表达阳性,而且荧光素酶表达的高低与插入lF工204片段 的长度,意即SBES的个数成正比。Smadl及Smads明显增加报告基因 的表达。而单个Smad4的质粒未能引起两个报告基因表达的增高,但 是Smad4能够显著增强Smadl和Smads的活性。提示Smad成员可激 活工FI204基因的表达。 应用点突变技术,我们在报告基因204一ZSBE一luc中p204的转录调 控区引入了两个SBES区的点突变,结果发现Smad失去激活作用,说 明在成骨细胞分化过程中需要Smad与pZO4基因转录调控区的直接相 互作用。有趣的是,如果仅突变两个SBE中的一个,Smad仍具有对于 pZO4的转录激活作用,提示单个的SBE足以保证Smad的结合。 为了进一步研究p204在骨发生过程中的作用,需要研究细胞环境下 p204蛋白水平对于成骨细胞分化的影响。由于P204有非常明显的抑制 细胞增殖的功能,我们使用可诱导表达p204的稳定细胞株作为模型进 行研究。在非诱导状态下,P204
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:R341

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