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微反应器的扫描电化学显微术用于生物分子的定量检测

彭学伟  
【摘要】:本论文共分三部分:Ⅰ 扫描电化学显微术(Scanning Electrochemical Microscopy,SECM)定量测定肿瘤相关标志物CA15-3;Ⅱ 微反应器的扫描电化学显微术测定酶;Ⅲ SECM定量测量中性粒细胞中的过氧化物酶。 第一部分我们提出一种新的方法—扫描电化学显微镜-酶免疫方法(SECM-ELISA)应用于乳腺癌相关抗原CA15-3的测定。实验中通过在水平基底上构筑微反应池的方法进行免疫反应,在基底上形成抗体—抗原—酶标抗体(Ab-Ag-Ab)的夹心结构;反应结束后,将微反应池去掉,通过对HRP催化底物BQ的检测间接测定抗原CA15-3(Ag)的量。我们对电极的材料,电极电位,缓冲溶液的pH和浓度,底物的浓度以及扫描电流随时间的变化等几种因素进行了研究,确定了CA15-3检测的最佳实验条件:pH 7.0的50mmol/LNa_2HPO_4-NaH_2PO_4缓冲溶液+0.1mol/L KCl;H_2Q的浓度1.0mmol/L,H_2O_2的浓度1.0mmol/L,检测电势-0.4V,检测时间为加入H_2O_2 6~8min后,电极用半径10μm金圆盘电极。同以往SECM-ELISA方法相比,该方法采用微反应池进行免疫反应,起到了富集Ag的作用,提高了检测的灵敏度。实验条件下CA15-3的线性检测范围在15U/mL~250U/mL之间,检测限可达到2.5U/mL左右。应用该方法对CA15-3试剂盒中的对照样进行测定,测定结果与试剂盒所提供数据相符合。 第二部分我们制作了一种适于SECM现场电化学检测用的微反应器,并用该微反应器对辣根过氧化物酶(HRP)进行了测定。该反应器由表面平整的有机玻璃上刻蚀的微池和池口上方覆盖的多孔膜构筑而成。多孔膜的孔径既要小于待检生物大分子HRP的直径,同时又要使HRP的底物H_2Q、H_2O_2及催化产物BQ等的分子能方便通过这些膜孔。这样通过检测扩散出反应器的BQ而测量HRP的量。实验中我们对膜材料、成膜溶液浓度、浇膜时机、有机溶剂等对HRP测定的影响进行了探索研究,确定了最佳实验条件。在最佳实验条件下我们对微反应器中的HRP成功进行了SECM检测,说明本方法用于检测溶液中的某些物质


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