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寡聚木糖生产用酶生产菌株筛选,酶的生产、分离纯化及应用机制研究

张东华  
【摘要】:低聚木糖是聚合度为二糖~十糖的寡聚木糖。低聚木糖除了不被人和动物的消化道消化吸收,无龋齿性等特性外,还能够显著促进人与动物肠道内双歧杆菌的增殖,促进人与动物对钙的吸收,对温度、pH具有广泛的稳定性,并具有适可的甜度与气味,因而可作为功能性食品添加剂和饲料添加剂,具有广阔的应用前景。 秸秆与玉米芯作为农作物生产的废弃物,如果处理不得当,会污染环境、妨碍交通,并导致一系列严重问题。本文以秸秆、麸皮和玉米芯为原料,通过植物共生菌一木霉的固体发酵进行内切木聚糖酶的生产,再以此酶水解从秸秆、玉米芯中抽提的木聚糖,生产高效双歧因子(益生元)—低聚木糖。这不但降低了环境污染的压力,亦为秸秆和玉米芯等农业废弃物的资源化、高值化、生态化利用开辟一条新的途径。 本文首先对本实验室保藏的纤维素、半纤维素降解菌株:木霉K93、木霉TH、木霉G、木霉T21、木霉TF、木霉C30、木霉S28、木霉N2C、黑曲霉An7658、黑曲霉An76等进行筛选比较,确定高产内切木聚糖酶的菌株——木霉TF(拟康氏木霉Trichoderma pseudokongii TF),该菌株的最适固体发酵培养基为玉米芯粉:麸皮=6:4:28℃:30%湿度;培养时间100小时;菌株表达木聚糖酶活达:1957 IU/mg。 该菌株固体发酵抽提粗酶液经过硫酸铵沉淀、分子筛层析和离子交换等方法,可从中纯化到了具有很高的木聚糖降解能力的内切木聚糖酶Ⅱ。通过SDS-PAGE,测出此酶的分子量约为21.7kDa。进一步的实验对该木聚糖酶的酶学的性质作了进一步的研究。实验结果表明该木聚糖酶在40℃,pH4.8~5.6时可以长时间保持活性,最适作用pH是5.2。金属离子对该酶的活性具有促进作用,该酶的Km为0.666×10~(-2) mol/L。依据分子量分类,该酶应属于G11家族木聚糖酶,但是依据对木聚糖酶的水解产物结果分类(该酶水解标准木聚糖时,0.9mL 1%底物30U 30分钟可达到平衡,而且产物以木二糖和木三糖为主),该酶应该属于F10家族木聚糖酶。此特性未见报道。 本文从秸秆、玉米芯中用3%的NaOH抽提水溶性木聚糖,通过乙醇沉淀法制得木聚糖粉,此法的水溶性木聚糖得率为10.38%和13.64%。通过对标准木聚糖与抽提木聚糖水解产物的HPLC分析,确定了低聚木糖生产的最适底物为玉米芯木聚糖,通过对粗酶液的预处理,优化了低聚木糖生产用酶的提取工艺。借助于HPLC分析,初步确定了酶的最适水解条件和工艺,该工艺在实验室水平的水解产物中低聚木糖含量为


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