小鼠和山羊胚胎干细胞建系及其分化为神经元细胞的基础研究

【摘要】：小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)分离建系的成功是发育生物学研究中的一个里程碑,而人类ESCs分离培养的成功进一步激发了科研人员对ESCs进行研究的热情。ESCs不仅可作为基因载体用于构建转基因动物,研究单基因功能,而且其广泛的分化能力以及体外可大量增殖的能力使其具备了用于细胞移植治疗人类疾病的潜能。如体外分化成神经元细胞,用于治疗神经退行性疾病。特别是随着治疗性克隆研究取得成功,使这一设想成为可能。然而,ESCs的有效分离培养以及体外高效分化成所需类型的功能细胞这两大关键问题直接影响将ESCs用于细胞移植治疗人类疾病的研究。本文基于这两大关键问题,开展了小鼠和山羊ESCs的建系和体外分化成神经元细胞的研究,以期优化ESCs的分离培养体系,提高ESCs建系效率。并探讨将ESCs高效分化成神经元细胞的新方法,为通过细胞移植治疗神经退行性疾病的研究奠定基础。 首先,以C57BL/6J小鼠囊胚为材料进行小鼠ESCs的分离培养。成功从3.5天的小鼠囊胚分离获得一株ESCs细胞系。体外培养传代超过20代仍保持未分化状态;ESCs核型为正常XX型;碱性磷酸酶及oct-4基因高表达;悬浮培养可以生成拟胚体(embryoid bodies,EBs);接种到裸鼠皮下可形成畸胎瘤;注射到ICR小鼠3.5天囊胚中,ESCs可以参与胚胎发育并产生嵌合体小鼠。研究结果证实,分离获得的小鼠ESCs具有发育的多能性。进一步研究发现分离获得的小鼠ESCs的增殖需要白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)和饲养层细胞。该研究在分离培养小鼠ESCs实验操作上积累的经验为进一步从事其它物种ESCs的分离培养工作奠定了基础。而且小鼠ESCs的获得为将其用于诱导分化并通过细胞移植治疗某些疾病的研究提供了良好的材料来源。 继此,在小鼠ESCs成功建系的基础上,以材料易获得的中国奶山羊囊胚为材料,经免疫外科法获得山羊内细胞团,采用添加40%小鼠ESCs条件培养基(embryonic stem cells conditioned medium,ESCCM)的培养体系,进行山羊ES样细