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重组南瓜胰蛋白酶抑制剂Ⅰ的表达参数优化、纯化工艺及其抑瘤活性研究

徐扬  
【摘要】:南瓜胰蛋白酶抑制剂Ⅰ(Cucurbita maxima trypsin inhibitor Ⅰ,CMTI Ⅰ)是一种来源于南瓜籽的经典类丝氨酸蛋白酶抑制剂,该家族由20多种成员组成。CMTI的分子量小、结构简单、作用机制清楚,是研究活性蛋白质分子结构与功能关系及作用机制的良好工具。但是CMTI家族各成员在分子量和结构方面相近,目前通过分离手段从南瓜籽中大量获得单一CMTI比较困难,从而限制了其药用开发研究。为此,我室构建了表达重组CMTI Ⅰ(rCMTI Ⅰ)的GS115毕赤酵母工程菌。为了对rCMTI Ⅰ进行深入的研究与开发,本论文研究和优化了rCMTI Ⅰ的表达条件,研究制备了rCMTI Ⅰ亲和纯化介质和纯化工艺,并首次研究了rCMTI Ⅰ的抑瘤和抑制肿瘤细胞降解基质膜的活性。研究内容与结果主要有以下几个方面。 1.不同发酵参数对rCMTI Ⅰ表达的影响研究 本研究利用含CMTI Ⅰ基因的GS115毕赤酵母菌,发酵表达rCMTI Ⅰ。通过发酵试验发现添加镁离子和酵母氮源可以增加CMTI的表达量,分别增加了15%和21%。研究发现pH值的变化对发酵培养有明显作用,利用缓冲液保证发酵环境适当的pH值可以促进CMTI Ⅰ的表达。通过正交试验找到了实现rCMTI Ⅰ高表达的最佳参数组合为:酵母氮源1.34%,胰蛋白胨8%,葡萄糖8%,镁离子(10mg/L),pH值6.0。用优化发酵参数进行发酵试验发现表达上清中的rCMTI Ⅰ活性是优化前的2.8倍。使用无机盐培养基发酵试验得到的表达上清中rCMTI Ⅰ活性略低于YPD培养基。 2.rCMTI Ⅰ亲和层析介质的制备及rCMTI Ⅰ分离纯化工艺的研究 采用亲和分离技术对rCMTI Ⅰ进行了分离纯化。首先用环氧氯丙烷活化黏胶纤维,并以胰蛋白酶为配基交联于其上获得了亲和层析介质,还考察了


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