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pLEGFP-N1基因转染骨髓基质干细胞的体外稳定性和体内体外成骨能力应用研究

孙晓东  
【摘要】:目的:兔骨髓中分离获得高纯度间充质干细胞(MSCs)进行体外扩增培养;pLEGFP-N1逆转录病毒基因转染MSCs,检测携带EGFP的MSCs体外蛋白表达能力,获得高效表达细胞株;观察研究MSCs和感染EGFP的MSCs体外生长规律和细胞生物学特性、体外成骨定向诱导能力和体内骨缺损修复成骨能力。 方法:1、抽取兔髂骨骨髓,利用Percoll分离液(1.073g/ml)进行密度梯度离心法从骨髓中分离骨髓间充质干细胞,体外培养扩增。 2、扩增重组逆转录病毒载体PLNCX-EGFP。重组逆转录病毒载体PLNCX-EGFP感染PT67包装细胞,MSCs转染,进行蛋白表达,携带EGFP的MSCs体外培养检测。 3、体外培养同生长期MSCs和转染了EGFP的MSCs,通过细胞生长曲线、吸光度测定,检测碱性磷酸酶表达、骨钙素生成对其进行定性检测和观察;同时向成骨细胞定向诱导分化,观察二者体外成骨能力。 4、兔下颌骨人造骨缺损模型,Ⅰ型胶原载体携带MSCs和转染了EGFP的MSCs体内骨缺损修复,进行对比研究。 结果:1、密度梯度离心结合贴壁培养获取了较高纯度的MSCs,而且较好地保持了细胞的活性。Percoll分离液(1.073g/ml)分离的骨髓单个核细胞24小时后贴壁,细胞呈圆形,48—72小时后展开呈纺锤形,梭形,迅速增值,原


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