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《山东大学》 2006年
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洋葱伯克霍尔德氏菌L68菌株邻苯二酚2,3-双加氧酶分离纯化、酶学性质、基因筛选及应用的研究

吕鹏  
【摘要】:随着经济的迅猛发展,引发的环境问题倍受关注。目前我国环境污染严峻,特别是芳香族污染物在土壤和水中的含量急剧上升,严重危及到了人们的生存。微生物的降解是芳香族污染物脱毒的最有效手段,亦是最终途径。因此,从环境中筛选高效的芳香族污染物降解菌,研究其降解途径关键酶及其基因的性质与特点,并将其应用到环境问题中去,具有重要的理论意义与实际意义。 本文从环境水体中分离到了多株苯酚降解菌,经过复筛,选择能够高效降解苯酚的L68菌株进行研究。经形态及生理生化鉴定与16S rDNA序列分析,从多相分类的角度并融合细菌系统分类最新研究成果,将L68菌株鉴定为Burkholderia cepacia(洋葱伯克霍尔德氏菌、洋葱伯克氏菌、洋葱球茎病伯克氏菌)。对洋葱伯克霍尔德氏菌L68菌株的苯酚降解性能进行了测定,研究结果显示,该菌株适宜生长温度为35℃左右。适宜生长pH值为7.0左右。在苯酚浓度为0.5g/L的苯酚无机盐液体培养基中35℃、160rpm摇瓶振荡培养L68菌株24h后,用4-氨基安替比啉法不能检测到酚。当培养基中初始苯酚浓度为0.8g/L时,L68菌株还能够保持一定的对苯酚的降解能力。L68菌株对苯酚的降解作用主要发生在指数生长期,菌体的生长与苯酚的降解之间呈现正相关。固定化可以提高L68菌株对苯酚的抗性。当培养基中初始苯酚浓度高达1.5g/L时,固定化L68菌株仍然可以对苯酚进行降解。 实验证实,洋葱伯克霍尔德氏菌L68菌株只产生邻苯二酚2,3-双加氧酶,通过间位裂解途径使邻苯二酚及其衍生物开环。本文首次报道了来源于伯克霍尔德氏菌的邻苯二酚2,3-双加氧酶的纯化与一些酶活性质。通过正交实验优化了该菌株的产酶培养条件,适宜产酶培养条件确定为1‰的苯酚含量,500ml三角瓶中250mi的装液量,0.2‰的酵母粉含量,培养基初始pH值6.0,接种量2.5%。L68菌株细胞抽提液经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-150柱层析和DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析后,经SDS-PAGE检测,达到了电泳纯,提纯倍数为309.66倍,收率为55.43%。测得该菌株所产邻苯二酚2,3-双加氧酶亚基分子量为34±1kDa,等电点为4.2。邻苯二酚和4-甲基邻苯二酚的Km值分别为4.9μM和9.9μM,是酶的良好底物。L68菌株邻苯二酚2,3-双加氧酶在紫外光谱吸收上具有普通蛋白的共性。荧光光谱分析表明,酶显示出很强的荧光,最大发射波长λ_(emmax)为
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:X172

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