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适冷海洋青霉纤维素酶和半纤维素酶分子生物学研究

侯运华  
【摘要】:与海洋动物、植物一样,海洋微生物也是一类重要的可再生的海洋自然资源,是丰富的基因库。尤其经过长期环境适应,海洋微生物作为产酶资源具有突出的特点和优势:具有显著的耐压、耐碱、耐盐、耐冷和多物种等特性;代谢易于调控,在低温条件下具有相对较高的活性。这些性质使得低温酶在工业应用和基础研究诸多方面引起浓厚兴趣,从而赋予海洋微生物酶独特的应用前景。 本文从黄海和东海的海底泥样中分离到51株海洋真菌,对其中6株产纤维素酶量较高的菌株进行了较为详细的研究。这6株海洋真菌的最适生长温度均在15-25℃,最高生长温度均不超过37℃。其中一株编号为FS010的菌株的纤维素酶活性最高,对其生长的适冷性和它产生的纤维素酶的冷活性进行了研究。另对其培养条件及影响产酶的因素也进行了分析,得到最优化的产酶培养基。 FS010菌株的最适生长温度为15℃,最高生长温度不超过37℃,在0℃也能够正常生长和产生孢子,属于典型的适冷菌。其最适产酶温度为15℃,在液体发酵培养基中培养3d,纤维素酶活力达到23.6U/ml。显微镜下观察发现FS010菌株的营养菌丝呈白色,有隔膜,产生青霉特有的帚状分生孢子头,未发现有性孢子,未见孢子囊和子囊壳等特化的细胞和组织体。形态学特征初步鉴定该海洋真菌为青霉。为进一步鉴定FS010菌株,我们通过通用引物PCR克隆了该菌株的18S rDNA基因,扩增长度为1797bp,测序结果分析表明和产黄青霉(Penicillium chrysogenum)KCTC6052的18S rDNA相似性最高,达99.2%。另克隆了该菌株线粒体小亚基rDNA基因,测序结果分析和18S rDNA基因的分析结果一致,因此我们判断适冷海洋青霉FS010属于产黄青霉。 采用生物信息学手段分析了8种丝状真菌外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ(CBHI)序列的保守性,发现CBHI进化具有高度的保守性。根据蛋白保守序列设计兼并引物,PCR扩增得到约1.0kb片段。测序结果显示该片段与构巢曲霉(Aspergillus Nidulans)cbh1相似性最高(79%)。在此基础上,采用热不对称嵌套PCR方法首次克隆了适冷产黄青霉FS010的cbh1基因。该基因含有长1590bp的开放阅读框,编码529个氨基酸,氨基酸序列中含有3个潜在的N-乙酰糖基化位点。对氨基酸序列同源性分析表明该蛋白属于糖苷水解酶第七家族。


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