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《山东大学》 2006年
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抗骨肉瘤/抗CD3双特异性单链抗体的创建及生物活性研究

丰荣杰  
【摘要】:目的:用基因工程的方法构建能同时特异性靶向人骨肉瘤细胞表面肿瘤相关抗原TP-3以及人T细胞表面TCR/CD3复合体CD3ε-链的双特异性单链抗体anti-CD3 x anti-TP-3 diabody,将其与骨肉瘤细胞、人T细胞共同培养,研究其通过活化T细胞所启动的细胞毒作用杀伤靶细胞的活性,并将这种活性与其亲本完整单克隆抗体McAb及亲本单链抗体片段scFv进行比较。 方法: 1 载体构建 质粒pHOG-αTP-3源于杂交瘤HP7,编码特异性靶向人骨肉瘤细胞相关抗原TP-3的单链抗体片段,质粒pHOG-dmOKT3来源于杂交瘤OKT3,编码特异性靶向人T细胞CD3ε-链的单链抗体片段。抗-TP-3的V_H区基因这一PCR片段,前端插入BglⅡ位点,后方续以编码LysLeuGlyGly的连接物,应用两个相应引物进行构建,构建的PCR片段用EcoRI及EcoRV进行消化,用EcoRI/EcoRV线性化质粒pHOG-dmOKT3进行连接,产生载体pHOGTP-3-CD3,它含有能够编码第一个杂合scFv(由抗-TP-3的V_H及抗-CD-3的V_L构成)的基因。另一PCR片段为抗-TP-3的V_L区基因,后方接c-myc及六聚组氨酸尾巴(hexahistidinyl tail),应用两个相应引物进行构建,此PCR片段在编码链3′末端有一个BglⅡ位点,用HindⅢ及XbaI消化,用HindⅢ/XbaI线性化质粒pHOG-dmOKT3连接,来生产载体pHOGCD3-TP-3,它含有能够编码第二个杂合scFv(由CD-3的V_H及TP-3的V_L构成)的基因。用BglⅡ/XbaI分别对pHOGCD3-TP-3及pHOGTP-3-CD3进行酶切,然后连接这两个酶切片段,构建表达质粒pKIDCD3 x TP-3,它编码两种杂合的scFv;最后用表达质粒pKIDCD 3×TP-3转染大肠杆菌K12系XL1-Blue株进行表达。 2 ScFv与diabody的表达及纯化
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R738.1

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