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《山东大学》 2007年
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利用新的丁内酯衍生物研究血管内皮细胞凋亡与老化关联及空泡化的机制

王玮玮  
【摘要】: 利用新的丁内酯衍生物研究血管内皮细胞凋亡与老化关联及空泡化的机制 血管内皮细胞控制着血管功能,其功能紊乱会导致各种心血管疾病。本论文旨在以血管内皮细胞为模型来研究凋亡与老化的关系及空泡化的机制。 本课题组在以前的研究中发现去除血清和生长因子诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡,那么,与此同时,细胞是否也发生了老化,本论文对此进行了研究,发现去除血清和生长因子也能诱导HUVECs老化。接着我们从化学遗传学角度出发,以去除血清和生长因子的HUVECs为模型,新的丁内酯衍生物3-苄基-5-(2-硝基苯氧甲基)-γ-丁内酯(3-Benzyl-5-((2-nitrophenoxy)methyl)-dihydrofuran-2(3H)-one,3BDO)为工具,对可能关联凋亡和老化的重要因子做了研究。 空泡化与细胞凋亡、坏死有密切关系,可能在老化过程中也有作用,所以对其机制的研究有重要的意义,本课题组在研究中发现低浓度的氯代奎宁(CQ)在人肺腺癌A549细胞中能诱导空泡化,但其在HUVECs中的作用尚不清楚,由此我们研究了CQ是否能诱导HUVECs的空泡化,并发现CQ(8μM t0 32μM)可以诱导HUVECs的空泡化,而且其作用是剂量依赖性的。接着为研究能够影响CQ诱导的空泡化的新因子,我们研究了3BDO对CQ诱导的空泡化的影响。 研究方法: 1.血管内皮细胞的提取和培养,参考Jaffe et al的方法[Jaffe,et al,1973] 2.倒置相差显微镜观察细胞形态变化 3.MTT检测细胞生长率 4.吖啶橙染色结合激光扫描共聚焦显微镜观察,检测细胞核凝集 5.TUNEL染色检测DNA片段化和凋亡率 6.SA-β-半乳糖苷酶染色检测细胞的老化程度 7.免疫荧光化学检测膜整连蛋白β4的表达 8.荧光探针DCHF检测ROS表达水平 9.中性红吸收法检测溶酶体空泡化程度 10.Na~+K~+—ATP酶活性检测试剂盒检测Na~+K~+—ATP酶活性研究结果: 1.去除血清和生长因子不但能诱导HUVECs的凋亡,也能诱导其老化。 2.3BDO(60-180μM)抑制此种情况下HUVECs的凋亡和老化。 3.3BDO(60-180μM)抑制此过程中膜整连蛋白β4水平的升高。 4.3BDO(60-180μM)不影响细胞内ROS的水平。 5.CQ(8μM-32μM)能以剂量依赖的方式诱导HUVECs的空泡化。 6.3BDO(60μM-180μM)抑制CQ诱导的空泡化,及酸性区室总体积(VAC)的增加。 7.CQ能增强Na~+K~+—ATP酶的活性,而3BDO对此也有抑制作用。 结论 1.本实验中我们发现除了凋亡外,去除血清和FGF-2也能诱导HUVECs发生老化。此结果与血管内皮细胞的凋亡和老化相平行的观点相一致。 2.我们首次发现新的小分子化合物3BDO能够抑制血管内皮细胞的凋亡和老化,这为研究凋亡与老化的关系提供了一个有效的工具。 3.膜整连蛋白β4参与3BDO的抗凋亡和老化作用,说明它可能是细胞凋亡和老化的信号交联中的一个重要因子。 4.在3BDO的抗凋亡和老化作用的过程中,ROS的水平未受到影响,提示在血管内皮细胞的凋亡和老化过程中可能存在一种不依赖于ROS的途径。 5.CQ能诱导HUVECs的空泡化,而此种空泡化也能被3BDO所抑制。说明CQ和3BDO可以作为一对分子探针来研究空泡化的机制。 6.Na~+K~+—ATP酶可能参与了3BDO抑制空泡化这一过程。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R329

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