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壳聚糖和药物分子与生物大分子相互作用及其分析应用的研究

陈艳晶  
【摘要】: 在生命体系中,核酸、蛋白质和糖类是生物体的三大基本要素,生物大分子间以及生物大分子与在生命过程中起重要作用的有机小分子通过氢键、电荷相互作用、范德华力以及疏水作用等分子间作用力组成各种功能特殊的分子集合体。蛋白质和配体的亲合作用是生命体系中许多化学过程引发的基础。对它的研究有助于人们对这些化学过程发生机理的了解。分子生物学和分子药理学的发展使人们能够从基因水平理解某些生命现象,并通过分子设计来寻找灵敏的核酸探针和有效的治疗药物。而生物大分子间的相互作用,几乎是所有生物学过程所必需的,是我们研究生命科学所必须了解的因果关系规律之一。因此,寻找和开发新的选择性好、灵敏度高、生物适应性好的生物大分子探针,探索生物大分子间以及与其他小分子间的相互作用具有重要的实际意义和学术价值。 本论文以分析化学,生物化学为研究背景,利用荧光技术、光散射技术、吸收光谱技术、圆二色谱技术和透射电子显微技术等手段研究了小分子及其配合物与核酸、蛋白质间的作用机理,以及蛋白质、核酸与低分子量壳聚糖之间的结合反应,并将纳米技术引入生物分析领域,建立了核酸以及蛋白质新的分析方法。论文共分五个部分。 论文第一部分评述了核酸和蛋白质发光探针的基本原理和研究进展,并对壳聚糖在化学以及生物医药领域的研究应用进行了综述,共引用文献167篇。 论文第二部分研究了以原儿茶酸(PCA)为配体的稀土Tb~(3+)-PCA配合物探针与核酸间的相互作用,并根据核酸对探针的荧光猝灭作用建立了核酸简便、灵敏的测定方法。在最佳实验条件下,核酸的浓度与探针荧光猝灭的强度成正比,ctDNA和yRNA的线性范围分别为3.0×10~(-8)-1.0×10~(-6)g/mL、1.0×10~(-6)-5.0×10~(-6)g/mL和1.8×10~(-8)-1.0×10~(-6)g/mL、1.0×10~(-6)-8.0×10~(-6)g/mL,检出限(S/N=3)分别为23ng/mL和9.9ng/mL。利用光散射技术、吸收光谱技术、黏度测定技术、圆二色谱等方法研究了配合物与核酸之间的作用机理。结果表明,Tb~(3+)-PCA配合物与核酸之间主要是静电结合作用。核酸骨架上带负电荷的磷酸根基团的氧通过和PCA的竞争与Tb~(3+)配位结合,从而导致了体系的荧光猝灭。从配合物与DNA及RNA的结合常数也可以看出,探针配合物与RNA的结合常数远大于与DNA的结合常数,且结合点位接近于零,这也证实,Tb~(3+)-PCA配合物与核酸之间主要是静电结合作用。Tb~(3+)-PCA配合物与核酸之间的相互作用使DNA双螺旋结构部分解旋,黏度降低,分子构象发生改变。 论文第三部分研究了在阴离子表面活性剂存在下蛋白质对莨菪葶(SLT)的荧光增强作用,在此基础上建立了蛋白质的定量测定新方法。研究表明,在最佳条件下体系增强的荧光强度与蛋白质的浓度成线性关系,BSA和HSA的线性范围分别为2.0×10~(-7)-2.5×10~(-5)g/mL和1.2×10~(-7)-2.2×10~(-5)g/mL,它们的检出限(S/N=3)分别为1.4×10~(-8)g/ml和1.1×10~(-8)g/ml。将该方法用于人血清白蛋白的测定,结果令人满意。实验条件下,体系的pH值低于BSA的等电点,BSA带有正电荷,与SLT通过疏水作用结合后,可进一步地与阴离子表面活性剂SDBS通过静电引力及疏水力结合,使SLT所处的微环境发生改变,极性减小,微黏度增加,从而减少了荧光分子与水分子间的碰撞,减少由此导致的能量损失;同时,研究表明BSA与SLT之间存在着能量转移,这两方面的因素共同促使了SLT的荧光强度增强。 论文第四部分研究了低分子量壳聚糖与核酸间的结合作用。核酸与壳聚糖间强烈的结合作用,导致体系光散射强度的急剧增加,因此建立了核酸光散射测定方法。方法简单,准确度、灵敏度高,在较宽的浓度范围内,光散射强度的增强与核酸浓度之间具有良好的线性关系,ctDNA和yRNA的线性范围分别为2.2×10~(-8)-4.0×10~(-6)g/mL和1.4×10~(-8)-4.0×10~(-6)g/mL,它们的检出限为(S/N=3)分别为11ng.mL~(-1)和6.5ng.mL~(-1)。该法已用于实际样品的测定,结果令人满意。机理研究表明,壳聚糖与DNA分子上的磷酸根集团通过氢键及静电作用结合,同时通过不同分子量的壳聚糖与DNA光散射实验以及圆二色谱研究,指出壳聚糖与核酸之间作用还包括疏水作用以及壳聚糖与核酸碱基的氢键作用。作用的结果使DNA构象发生改变,熔解温度降低,体系光散射强度增强。 论文第五部分利用吸收光谱、荧光光谱以及荧光偏振技术研究了蛋白质与壳聚糖间的相互作用。从壳聚糖对蛋白质在200nm左右的吸收峰的影响可以看出,壳聚糖的加入引起BSA的构象发生改变,螺旋含量增加。在较低的壳聚糖浓度范围内,BSA螺旋含量增加迅速;随着壳聚糖浓度的增加,BSA螺旋含量增加的速率变小。并以ANS为探针,研究了壳聚糖对BSA分子表面疏水性的影响。研究表明,壳聚糖分子与BSA分子间的相互作用与壳聚糖溶液浓度的高低有着密切的关系。在不同浓度的壳聚糖溶液中壳聚糖分子有着不同的存在形态。低浓度壳聚糖溶液中壳聚糖分子呈现为扩张型的线性分子,因而与BSA分子间作用充分,使BSA分子中螺旋含量迅速增加,结合常数较大;由于疏水区域的相互融合,使BSA分子表面疏水性增加,探针分子的偏振度加大。高浓度壳聚糖溶液中壳聚糖分子间的聚集及分子链本身的卷曲,使其与BSA分子间的作用减弱,引起BSA构象变化的幅度减小,结合常数降低。 论文第六部分用不同低分子量的壳聚糖制备成壳聚糖纳米微粒,并初步研究了它的光谱性质及其作为药物载体与药物分子姜黄素间的相互作用。结果表明,壳聚糖纳米微粒的粒径与壳聚糖分子量的大小有关。与壳聚糖分子相比,壳聚糖纳米粒子的光谱性质有了一定的变化。对壳聚糖及其纳米粒子与姜黄素间的结合常数及结合点位数的计算结果说明,壳聚糖制成纳米粒子后,与姜黄素结合作用更强。纳米粒子的形成使壳聚糖分子的比表面积增大,与姜黄素分子间的接触面积增加,因而使得两者之间的结合常数增强,结合点位增加。相同浓度下,壳聚糖的分子量越小,形成纳米粒子后其比表面积的增加越大,因而其结合常数及结合点位数的增加幅度就越大。 本论文的主要特点和创新点: 1.利用荧光光谱、吸收光谱、光散射和圆二色谱等光谱方法以及黏度测定技术,详细研究了Tb~(3+)-PCA配合物与核酸之间的作用机理。研究认为,核酸骨架上带负电荷的磷酸根基团的氧通过和PCA的竞争与Tb~(3+)配位结合,导致了体系荧光猝灭,DNA双螺旋结构部分解旋,黏度降低,分子构象发生改变。并由此建立了核酸新的荧光光度测定法。 2.研究发现,在阴离子表面活性剂(SDBS)存在下蛋白质对莨菪葶(SLT)的荧光强度具有明显的增强作用。研究指出,SLT的荧光增强主要来源于SDBS和蛋白质为SLT提供的疏水微环境以及蛋白质与SLT分子间的能量转移。在此基础上建立了蛋白质的定量测定新方法。 3.研究了低分子量壳聚糖与核酸间的结合作用,并由此建立了核酸的光散射测定方法。方法具有简便快速和线性范围宽等特点。机理研究指出,壳聚糖与核酸间的相互作用,除静电作用和氢键外,还有疏水作用存在。 4.研究表明,壳聚糖分子与BSA分子间的相互作用与壳聚糖溶液浓度的高低有着密切的关系。低浓度溶液中壳聚糖分子为线性构型,与BSA分子间作用充分,BSA分子构象迅速改变,疏水区域的相互融合,使结合常数较大。高浓度溶液中壳聚糖分子间的聚集及分子链本身的卷曲,使其与BSA分子间的作用减弱,引起BSA构象变化的幅度减小,结合常数降低。 5.研究表明,壳聚糖纳米粒子粒径的大小与其分子量有关。制成纳米粒子后,其光谱性质有了一定的变化,与药物分子姜黄素间的结合作用增强。 上述研究,不仅提供了生物大分子核酸和蛋白质新的分析方法,而且探讨了小分子与生物大分子间以及生物大分子间的作用机理,因而本研究具有重要的学术价值和应用价值。


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