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超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3几丁质代谢途径及相关嗜热酶系的研究

刘波  
【摘要】: 几丁质是自然界第二大类有机物质,其降解是自然界中营养物质循环利用的重要过程。通过对极端嗜热球古菌Pyrococcus horikoshii OT3基因组序列分析,该古菌可能存在一条新颖的几丁质降解途径。通过鉴定该古菌中与几丁质代谢相关的保守ORF簇编码蛋白的生化性质,不但能够鉴定该古菌特有的几丁质代谢途径以及相关蛋白(嗜热酶)协同作用降解几丁质的机理,而且能够在详细研究各种嗜热酶催化特性、热稳定机制、催化机制的基础上,开发在生物工程领域具有应用价值的极端酶类。本论文研究主要有以下几个部分: 1.极端嗜热球古菌Pyrococcus horikoshii几丁质代谢途径的研究 采用PCR方法从Pyrococcus horikoshii OT3基因组中克隆出PH0511(外切氨基葡萄糖苷酶)、PH0499(几丁二脱乙酰酶)、PH0495(甘油酸激酶)基因,插入到pET15b表达质粒中,再进行E.coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL表达,并通过亲和层析及离子交换层析对重组蛋白进行纯化。利用分子筛、薄层层析、荧光扫描和放射性磷标记等技术对嗜热酶的催化特性以及生化性质进行了详细的研究。 通过对几丁质代谢相关嗜热酶类性质鉴定,推测在极端嗜热球古菌P.horikoshii OT3中存在着特有的几丁质代谢途径。其主要特征是几丁二脱乙酰酶Dac_(ph) (PH0499)能够将几丁寡糖(GlcNAc_n)或几丁二糖(GlcNAc_2)先脱去乙酰基,生成非还原性末端部分脱乙酰化的几丁寡糖或GlcN-GlcNAc,然后在外切氨基糖苷酶的水解作用下生成GlcNAc_(n-1)与GlcN,随后Dac_(ph)将GlcNAc_(n-1)再脱去乙酰基,并在外切氨基葡萄糖苷酶的上述配合作用下,从而最终将几丁寡糖降解为产物氨基葡萄糖。 虽然P.horikoshii缺少典型的几丁质酶,但在外切氨基葡萄糖苷酶和脱乙酰酶以及体内其他糖苷水解酶(如甘露糖苷酶,PH0501)的共同作用下,能够将其海底生活环境中的几丁类杂多糖降解为氨基葡萄糖,从而进入下一步代谢途径。甘油酸激酶的作用可能是参与糖酵解过程中古菌特有的非磷酸化的ED途径。 2.极端嗜热球古菌Pyrococcus horikoshii 0T3几丁质代谢相关嗜热酶的表达及性质研究 2.1外切氨基糖苷酶P.horikoshii外切氨基糖苷酶(BglA_(ph),ORF PH0511)以一稳定的二聚体形式存在,还原剂及热变性对其在SDS-PAGE过程中的聚体结构没有明显影响。该酶的最适生长温度与最适pH分别为90℃与pH 6.0。该酶具有明显的热稳定性,其在90℃时的半衰期为9h,是迄今报道的热稳定性最高的氨基葡萄糖苷酶。该酶能够从壳聚糖、壳寡糖或部分脱乙酰化的几丁寡糖的非还原性末端脱去一个氨基葡萄糖残基(GlcN),生成氨基葡萄糖与少一个残基的几丁类多糖。该酶对乙醇、二丁醇、DMSO、SDS、尿素和重金属离子Mg~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)、Sr~(2+)和Ni~(2+)等具有抵抗作用。通过本研究提出的一种新的氨基葡萄糖苷酶的测定方法,对预测的该酶的催化氨基酸残基进行点突变蛋白的动力学分析,显示该酶的催化机理可能不属于典型的糖苷水解酶35家族催化机制。缺失突变分析结果显示,其C-末端约100个氨基酸对于维持该酶的热稳定性具有重要的作用。 2.2甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸) 分子筛结果显示,P.horikoshii甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸,GK_(ph),ORF PH0495)为100 kDa,SDS-PAGE分析其蛋白质分子量为47 kDa,说明该酶主要以二聚体形式存在。该酶的最适生长温度与最适pH分别为45℃与pH 7.0,在100℃时,该酶能保持最大活力的50%以上。该酶具有极其显著的热稳定性,在70℃、80℃及90℃热处理12小时后,酶活力没有明显的下降。利用一种研究提出的一种新的甘油酸激酶放射性磷酸标记检测方法以及传统的光谱吸收结合辅酶的检测方法,证明该酶能够利用ATP、GTP、CTP、UTP、ADP和Ppi作为磷酸供体,以二价余属离子Mg~(2+),Mn~(2+),Co~(2+),Ni~(2+)为辅助因子,催化D-甘油酸生成2-磷酸甘油酸。该酶具有独特的磷酸供体底物特异性且最大活性磷酸供体为焦磷酸。单价金属离子能够明显地促进该酶的活性。还原剂对酶活力有一定促进作用。通过序列分析及结构比对,该酶属于甘油酸激酶三分法分类中的第一家族。 2.3几丁二糖脱乙酰酶 通过PCR技术得到P.horikoshii几丁二糖脱乙酰酶基因(ORF PH0499),将其克隆到重组质粒pET15b中,转化大肠杆菌后表达获得可溶的P.horikoshii几丁二糖脱乙酰酶(Dac_(ph))。该酶的最适生长温度与最适pH分别为90℃与pH 7.0。研究证明该酶能够脱去N-乙酰氨基葡萄糖、几丁二糖的一个乙酰基,并与氨基葡萄糖苷酶(BglA_(ph))共同作用水解几丁二糖生成氨基葡萄糖,因此被命名为一种几丁二糖脱乙酰酶。 2.4几丁质内切酶和外切酶 通过对P.furiosus中的几丁质内切与外切酶催化结构域进行研究,几丁质内切酶能够随机的水解几丁质或几丁寡糖内部的糖苷键,而外切酶(催化结构域)水解几丁质或几丁寡糖非还原性末端的第二个糖苷键。 3.几丁质代谢相关嗜热酶的应用研究 通过对几丁质代谢相关的嗜热酶的性质研究,探讨了其在生物催化与生物降解领域的应用。几丁质内切酶与外切酶在食品领域对于天然几丁质类物质的降解、生产几丁寡糖等方面具有广阔的应用前景。外切氨基葡萄糖苷酶对于制备氨基葡萄糖(优化盐酸水解方法)、分析非还原性末端带有氨基葡萄糖的壳聚糖、部分脱乙酰化的几丁寡糖、肽聚糖等几丁类糖链的结构具有一定的应用价值。外切氨基葡萄糖苷酶与几丁二糖脱乙酰酶配合,可以有目的的降解与转化几丁寡糖。甘油酸激酶则可以利用D-甘油酸来制备2-磷酸甘油酸。


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