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《山东大学》 2007年
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芦苇富集重金属相关基因—γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的克隆与功能的初步分析

赵翠珠  
【摘要】: 植物修复技术(phytoremediation)是当前资源环境领域的研究热点。目前发现的超富集植物多数生物量小、生长速度慢、富集重金属的种类单一,成为限制修复技术在实际应用中的瓶颈。因此,利用基因工程的方法把重金属富集/耐性相关基因导入生长速度快、生长量大的植物中,筛选和培育高产、速生的重金属超富集植物,是开发和利用植物修复技术进行污染土壤的净化和生态恢复的有效途径。 重金属胁迫下,植物启动多种防御机制,降低重金属离子对细胞的毒害。其中螯合蛋白,如谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和植物络合素(Phytochelatins,PCs)发挥了重要作用。PCs通过Cys的疏基与重金属发生络合作用,降低了胞质中重金属离子的毒性。GSH不仅能直接结合重金属离子,而且是植物络合素(PCs)的合成前体。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)是GSH生物合成中的关键酶。 本研究中,选用可富集Cd、Zn、Cu、Au、Se等多种重金属的植物修复模式植物芦苇(Phragmites communis Trirn.)作为实验材料。分离克隆了其γ-ECS基因(PcGCS)。构建了PcGCS基因的酵母表达载体和植物表达载体,建立了生物量高和生长快的草坪草剪股颖(Agrostis palustris Huds.)植株再生体系及其农杆菌介导的愈伤组织转化体系,将PcGCS基因转入剪股颖中。 主要获得以下结果: 1、采用RACE-PCR技术,从芦苇中分离克隆了编码γ-ECS的全长新基因,命名为PcGCS。序列分析发现,PcGCS ORF区核苷酸长度为1125bp,推测编码的蛋白质具有374个氨基酸,较少于已克隆的水稻和玉米的氨基酸残基数,与小麦的该基因的氨基酸残基数相近。其分子量为Mr43032,小于目前所有已知的水稻和玉米中该基因推测编码蛋白的分子量,但大于来源于细菌的gshⅠ基因编码蛋白的分子量。等电点为6.25,与该家族的已知蛋白相似,均为酸性蛋白; 2、构建了酵母表达载体pDR-GCS,并转化酵母。谷胱甘肽含量测定结果表明,转化菌中谷胱甘肽含量比未转化菌的含量提高30%,证明该基因具有提高酵母转化菌合成谷胱甘肽的功能; 3、将PcGCS基因克隆入含有35S启动子和nptⅡ选择标记基因的植物双元表达载体pROK2中,构建了高效表达的植物表达载体pROK-GCS; 4、取培养7d的胚性愈伤组织,在携带pROK-GCS质粒的农杆菌AGL1中侵染和共培养后,经5 mg/L卡那霉素筛选,获得132棵绿色抗性植株。PCR检测结果表明,其中5棵为阳性植株,转化效率达3.8%。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q943.2

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