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《山东大学》 2007年
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1.sla/lp基因敲除鼠模型的建立 2.sla/lp启动子的鉴定及其特点

王春霞  
【摘要】: [研究背景]自身免疫性肝炎(AIH)是三种自身免疫性肝脏疾病之一,在各种族、年龄段和性别均有发病,以女性和儿童多见。AIH病人对免疫抑制治疗的反应非常好,但是,如果不及时治疗,则预后比较差(Krawitt 1996)。因此,该病预后的关键是早期正确的诊断。然而,目前尚没有一项理想的、特异性实验室诊断指标。其诊断须结合血清学检查(高IgG)、肝活检、临床表现及非特异性自身抗体(ANA、SMA、pANCA和LKM等)的存在进行综合判断。在所有的AIH病人中,约20%的病人出现抗可溶性肝抗原/肝胰抗原(抗-SLA/LP)抗体,这是目前唯一的一项具有100%特异性的实验室指标(Wies et al.2000)。 可溶性肝抗原/肝胰抗原(SLA/LP)是一种可溶性细胞浆蛋白,分子量约50kDa,在体内各组织中包括胚胎中广泛表达,但在肝、胰、肾、肺等酶代谢活跃的器官高表达,活化的T细胞也过量表达,推测其可能为一种或一组酶(Wies et al.2000)。另有研究指出,SLA与UGA serine tRNA-protein complex有关,可能是硒代半胱氨酸代谢途径的重要一员(Costa et al.2000)。SLA/LP的化学本质和生物学功能直到最近才被实验证实。研究发现,SLA/LP蛋白是真核生物和古生菌中硒蛋白合成过程中的一个关键酶--磷酸丝氨酰-tRNA:硒代半胱氨酰-tRNA合成酶,催化磷酸丝氨酰-tRNA转化为硒代半胱氨酰-tRNA,从而将用于蛋白质合成的第21种氨基酸--硒代半胱氨酸运输到核糖体,合成硒蛋白(Chambers et al.1986;Zinoni et al.1986;Yuan et al.2006;Xu et al.2007)。目前,对SLA/LP蛋白的表达调控知之甚少,尚未见相关文献发表;同时对SLA/LP蛋白在AIH中的自身免疫作用机理也不清楚。因此,如果对SLA/LP了解的多一些,对明白SLA/LP的自身免疫性及AIH的发病机理都会有帮助。为此,本课题计划建立sla/lp基因敲除鼠模型,并对sla/lp基因的启动子进行定位,寻找存在的转录因子,并确定其在SLA/LP蛋白表达中的调控作用。 [研究目的]创建sla/lp基因敲除鼠模型,研究其表型变化,进一步阐明SLA/LP功能,同时为SLA/LP功能及AIH的相关研究提供一个比较理想的动物模型。 [研究方法] (1)利用基因克隆技术,构建基因敲除载体。(2)将基因敲除载体电转到胚胎干细胞(R1 ES)中,通过同源重组完成基因序列的置换。(3)药物筛选耐药克隆,Southern Blot筛选阳性重组子克隆。(4)用显微注射方法,将发生重组后的ES细胞注射到来自C57BL/6鼠的3.5天的囊胚中,并移植到代孕母鼠体内,以产生嵌合体小鼠。(5)将雄性嵌合体小鼠与野生型雌性C57BL/6小鼠交配,获得杂合体小鼠。(6)将杂合体小鼠交配,获得基因敲除纯合体小鼠。(7)分析基因敲除鼠的表型变化。 [结果]构建的基因敲除载体含有两个同源序列,分别称作5'Arm和3'Arm。5'Arm长2007bp,含有从内含子2-3到外显子3的序列;3'Arm长4256bp,含有从内含子6-7到外显子8的序列。同源重组后,将敲掉自外显子3到内含子6-7之间长约5867bp的一段序列。在5'Arm后,加入了EGFP基因;在两个同源序列之间含有阳性选择标记-新霉素基因;在两个同源序列之外含有阴性选择标记-单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因,用于阳性重组胚胎干细胞克隆的药物筛选。将构建的基因敲除载体电转到ES细胞中后,用G418和ganciclovir筛选耐药克隆。在400多株耐药克隆中,Southern Blot分析确定了3株阳性重组子克隆。 利用阳性ES细胞诞生了7只具有高度嵌合性的雄性嵌合体小鼠。因为ES细胞来自129/Sv小鼠,囊胚来自C57BL/6小鼠,故嵌合体小鼠毛色为黑色和棕色。将嵌合率高于80%的雄性嵌合体小鼠与野生型C57BL/6雌鼠杂交后,后代均为黑色,PCR检测无新霉素基因的存在,未产生应该为棕色的杂合体子代小鼠。 [结论]基因敲除载体被成功构建,且可产生嵌合体小鼠,但是遗传性状无法传递给子代。需选择其他阳性ES细胞克隆重复进行显微注射,或者构建新的敲除载体,以克服遗传性状不能传递的缺陷。 第二部分:sla/lp启动子的鉴定及其特点 [研究目的]对sla/lp基因的启动子进行定位,寻找可能存在的转录因子及其作用,从转录水平上阐明sla/lp基因在正常组织中的表达调控,揭示SLA/LP蛋白在AIH病人中产生自身免疫性损伤的部分机理。 [研究方法] (1)利用基因克隆技术将一长1740bp的小鼠sla/lp基因片段克隆到荧光素酶报告载体—pGL3 basic vector。(2)将构建的质粒分别转化到HEK293,RAW264.7和Hepa1-6这三种不同的细胞系中进行荧光素酶实验。(3)荧光素酶实验证实该1740bp片段具有起始转录功能后,经系列5’端剪切和3’端剪切定位核心启动子位置。(4)利用计算机软件预测可能存在的转录因子结合位点,检测对这些位点进行点突变后各克隆荧光素酶活性的变化,从而初步确定这些转录因子结合位点是否存在及其作用。(5)利用凝胶迁移实验(EMSA)和超凝胶迁移实验(Super shift)对转录因子结合位点加以确认。 [结果] (1) 1740bp小鼠sla/lp基因片段位于转录起始点上游并含盖转录起始点(-1623~+117)。荧光素酶实验证实其具有启动子活性并且活性具有方向性,表达在三种细胞中无差异。(2)经过系列剪切后,具有起始转录功能的最短片段定位于-99~-37,一个长63bp片段内。(3)该63bp片段不存在典型的核心启动子元件,如TATA盒,起始子(Inr),下游启动子元件(DPE)和TFIIB识别元件(BRE)。(4)CpGProD和Alibaba2.1软件预测,sla/lp基因启动子很可能是CpG岛型启动子,并预测在63bp片段内存在两个Sp1结合位点(-85~-76和-55~-41),一个RAP1结合位点(-71~-62)。在63bp片段上游存在一个Oct-1结合位点(-184~-175)。(5)63bp片段内的两个Sp1结合位点及RAP1结合位点分别经过点突变后,所产生的克隆几乎完全丧失起始转录的功能;而Oct-1结合位点的点突变克隆则可以在不同的细胞系中提高转录能力2.8到6.3倍。(6)这4个转录因子结合位点的凝胶迁移实验均出现了滞后带;其中,Sp1(-85~-76)和Oct-1(-184~-176)的Super shift实验出现超滞后带,证实了这两个位点的存在;而Sp1(-55~-41)和RAP1(-71~-62)结合位点未出现超滞后带,故尚不能确定它们一定存在。 [结论] (1) sla/lp基因的启动子为CpG岛型启动子,核心启动子位于一个长63bp的片段内,位于转录起始点上游-99~-37的位置,不含有典型的核心启动子元件,内含一个转录活化因子Sp1、一个Sp1样和一个可能的RAP1结合位点。其上游含有转录抑制因子Oct-1结合位点。(2) SLA/LP蛋白在体内正常的广泛表达是转录活化因子Sp1,RAP1和转录抑制因子Oct-1作用之间动态平衡的结果。(3)导致该平衡失衡的因素可能是AIH病人产生抗-SLA/LP抗体的基础。 [总结]在建立sla/lp基因敲除鼠模型过程中,成功的构建了基因敲除载体,并顺利地诞生了嵌合体小鼠,但改变后的基因未能成功地传递给子代获得杂合体小鼠,这里面含有许多经验教训,在今后的工作中,许多方面需要给予更多的关注。在ES细胞的培养过程中,要尽量避免或降低各种可能引起分化因素的作用,以最大程度提高遗传性状的可传递性。 sla/lp基因的启动子为CpG岛型启动子,核心启动子位于一长63bp片段内,缺乏典型核心启动子元件,如TATA box,Inr,DPE,BRE等;转录因子Sp1是sla/lp基因的转录活化因子,Oct-1为转录抑制因子,同时还可能存在转录活化因子RAP1的结合何点,为一多调节因子型启动子,同时也提示了sla/lp基因表达调控的复杂性。SLA/LP蛋白在体内的正常表达应该是Sp1/RAP1和Oct-1作用动态平衡的结果;引起该平衡失衡的因素可能是导致SLA/LP在AIH中产生自身免疫性的原因之一,因此,进一步寻找这些因素将会是非常有意义的工作。 目前找到的调控sla/lp表达的转录因子,无论是活化因子还是抑制因子,均是在体内广泛表达的、无组织特异性的因子,这从一个侧面说明了为什么SLA/LP在体内各组织中广泛表达,而不具有组织特异性。这些转录因子的浓度和活性可能是控制SLA/LP蛋白在各组织中表达量不同的因素之一。同时,这种表达特点也带给我们这样一个问题,即在体内广泛表达的SLA/LP,为什么在AIH中只影响到肝脏,而不影响其他组织器官呢?是因为SLA/LP在AIH病人肝脏中的异常表达造成的吗?但我们的另一个实验结果显示SLA/LP在AIH、其他肝脏疾病以及健康对照之间的表达没有明显差异(Wang et al.投稿)。一个可能的解释是,SLA/LP在肝脏发生的某种修饰作用导致了肝脏特异性、病理性的免疫损伤。的确,硒主要在肝脏代谢,并以硒蛋白的形式运输到其他的组织器官(Gromer et al.2005;Schweizer et al.2005)。在此过程中,受某种因素影响后,可能形成了一种具有抗原性的核糖核蛋白复合物,诱导了针对SLA/LP蛋白的病理性自身免疫反应。当然,这需要后续实验加以证实。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q78

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