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《山东大学》 2008年
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淋巴性脑水肿大鼠的血压变化及其机制探讨

郑延红  
【摘要】: 脑水肿(brain edema,BE)是指脑组织含水量增加引起脑容积的扩张,为中枢神经系统对各种原因造成的脑损害产生的一种组织病理反应,是一个重要的病理生理过程。它是脑外伤、脑缺血或者缺氧的严重并发症,表现为脑容积扩大、颅内压增高,甚至发生脑病死亡,因而危害极其严重。脑水肿时液体的积聚可在细胞外间隙,也可在细胞膜内。前者称为血管源性脑水肿,多见于脑损伤、脑肿瘤等病变的初期,主要是由于毛细血管的通透性增加,导致水分在神经细胞和胶质细胞间隙潴留,促使脑体积增加所致;后者称为细胞中毒性脑水肿可能是由于某些毒素直接作用于脑细胞而产生代谢功能障碍,使钠离子和水分子潴留在神经细胞和胶质细胞内所致,但没有血管通透性改变,常见于脑缺血、脑缺氧的初期。我们研究发现尚存在另一种以大分子物质潴留为始动因素和主要特征的淋巴性脑水肿(lymphatic brain edema,LBE)。实验证实,脑内淋巴引流途径的受阻可引起神经细胞及胶质细胞外液增加,脑组织血浆蛋白等大分子物质及小分子物质潴留,血管周围间隙扩大并充满液体,即形成不同于以上两种水肿的LBE。当然这种分类方式有待商榷。 这种脑水肿与其他两种类型的脑水肿的关系如何?淋巴性脑水肿的机制何在?至今未见相关的报道。因此,我们采用手术阻断颈部淋巴引流的方法,建立LBE的模型,进而研究淋巴性脑水肿的发生、发展过程,探索其发生机制,为进一步研究淋巴性脑水肿相关的疾病治疗提供理论依据。迄今为止,虽尚未在脑内发现衬有内皮细胞的淋巴管结构,但已有确凿的证据证实了淋巴引流的存在。脑的淋巴引流不仅参与脑脊液的循环,而且担负着脑脊液及脑组织间隙液中蛋白质等大分子物质的重吸收,其在维持脑组织内环境稳态、颅内压稳定以及脑的正常生理功能等方面发挥着重要作用。 一方面,在临床上LBE见于头颈部急性、慢性炎症,喉癌、甲状腺癌、唇癌、牙龈癌、唾液腺肿瘤等行颈部淋巴结清扫手术,以及颈部外伤、气管切开、食道上段肿瘤的放疗等损伤颈部淋巴管及淋巴结,造成脑淋巴回流受阻。但由于其症状及体征缺乏特异性,长期以来相当一部分病人被误诊为“假性脑瘤”、“耳源性脑积水”、“原发性急性脑病”等,往往延误了治疗。因而研究LBE具有非常重要的临床意义。另一方面,淋巴性脑水肿大鼠在颈部淋巴结摘除后,颅内淋巴引流受阻,产生颅内压增高,形成单纯性的脑水肿模型。因为其排除机体的心脑血管基础病变及脑缺血缺氧的病理情况,研究BE这一病理生理过程的发生机制,对临床有效治疗各种脑部疾病共同存在的BE提供一条崭新的途径。 近十年来,泰山医学院脑微循环研究室在脑淋巴引流的生理和病理生理意义等方面做了积极的探索。主要工作在于脑淋巴引流途径及引流方式,淋巴性脑水肿后脑组织形态结构及功能的改变。研究表明,LBE引起了一系列生理指标,如皮层局域脑血流量、体感诱发电位、脑电图及颈淋巴压的改变。然而,LBE形成后血压的变化及其产生机制的系统研究未见报道。以往实验表明麻醉状态下LBE后大鼠血压升高、心血管功能降低。但是麻醉药物本身就抑制血压调节功能,从而对血压产生影响,掩盖了LBE的真实作用。大鼠在不使用麻醉剂的情况下,即清醒自由活动状态下,LBE对清醒自由活动大鼠的血压的影响如何?为此,我们首次研究了LBE对清醒自由活动大鼠血流动力学参数的影响。 研究表明,正常情况下血压不是固定不变的,而是自发变化的。血压的调节是一个涉及多系统多环节的复杂过程。目前较为肯定的血压调节因素主要包括神经系统、肾素-血管紧张素系统、肾上腺素能系统、缓激肽-前列腺素系统、内皮源性血管活性物质以及血管加压素等。由于血压的神经调节是最主要的调节方式,是通过动脉压力感受性反射(arterial baroreflex,ABR)实现的,然而LBE对清醒自由活动大鼠的ABR是否产生影响及这种影响的结构基础尚未见系统研究报道。本实验首次进行了LBE对孤束核的结构和功能的影响的系统探讨。 水通道蛋白-4(aquaporin-4,AQP4)在正常大鼠脑内具有广泛分布,主要表达于与血脑屏障相关的毛细血管内皮细胞及其相连的胶质细胞,其次是脑室室管膜上皮细胞、脑室脉络丛上皮细胞和下丘脑神经元。脑干神经核团和大脑皮质部分神经元也有分布。AQP4是脑组织中表达最高的水孔蛋白,在脑内主要参与脑内水代谢以及全身水代谢的调节。众多文献已经证实,AQP4参与了脑缺血、脑出血及脑创伤后脑水肿的形成和消散。然而,淋巴性脑水肿形成机制中AQP4的地位尚不明确。为此,本实验首次研究了LBE与AQP4基因及蛋白表达的关系,明确了AQP4在LBE中的作用。 研究报道,心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)的天然内源性拮抗剂,二者在血压的体液调节中发挥了重要的作用。但LBE对ANP及血管紧张素(angiotoninⅡ,AngⅡ)血浆水平有无影响,二者是否参与了LBE这一病理生理过程中血压改变的作用尚未见报道。本实验首次研究了LBE对AngⅡ和ANP血浆含量水平的影响,探讨了其在淋巴性脑水肿所致血压变化中的作用。 研究目的 1.探讨LBE对清醒自由活动大鼠血压及血压调节的影响。 2.探讨孤束背内侧亚核的组织病理变化在LBE后血压及血压调节的改变中的作用。 3.探讨AQP4在LBE中的作用。 4.探讨血浆AngⅡ及ANP在LBE后血压及血压调节的改变中的作用。 通过这四部分实验研究,以期为深入阐明淋巴性脑水肿对清醒自由活动大鼠血压的影响提供较新的神经、体液的以及分子生物学实验依据。 材料与方法 1.淋巴性脑水肿动物模型的建立 选用健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠,参照Casley-Smith创立的并由本实验室改进的方法建立淋巴性脑水肿动物模型。具体方法如下:大鼠在盐酸氯胺酮50 mg/kg和地西泮5 mg/kg腹腔注射麻醉下,取仰卧位固定,颈部正中切口,分离两侧的颈浅淋巴结(每侧各3~5个),结扎相应的淋巴管,并摘除颈浅淋巴结。然后进一步分离出两侧的颈深淋巴结(每侧各1~2个),同法结扎其两端的淋巴管,并摘除颈深淋巴结,阻断颈部淋巴引流,造成淋巴性脑水肿。 2.动物分组 动物随机分为以下三组:(1)正常组(Normal组):仅进行股动、静脉插管进行血压监测,不接受颈部手术,不形成淋巴性脑水肿。(2)淋巴性脑水肿假手术组(Sham组):只进行颈部假手术,即分离颈部的淋巴管及淋巴结,但不结扎淋巴管,也不摘除淋巴结,不形成淋巴性脑水肿。(3)淋巴性脑水肿模型组(LBE组):进行颈部手术,分离颈部的淋巴管及淋巴结,结扎淋巴管,并且摘除淋巴结造成淋巴性脑水肿。 3.检测指标与方法 (1)应用清醒动物血压监测技术观察淋巴性脑水肿术后清醒自由活动大鼠血压、心率、血压波动性、心率变异性及压力反射敏感性随时间的变化规律。 (2)应用透射电镜技术观察LBE后孤束核背内侧亚核(dorsomedial nucleusof the solitary tract,dmNTS)病理组织学改变。应用抗神经元抗体免疫组化染色检测LBE后dmNTS内主要参与血压调节的神经递质谷氨酸(glutamic acid,GLU)及γ-氨基丁酸(gamma aminobutyric acid,GABA)表达的改变。应用抗神经元抗体免疫荧光染色dmNTS内谷氨酸脱羧酶67(glutamic aciddecarboxylase-67,GAD67)表达的改变。应用RT-PCR及Western blotting技术检测LBE对孤束核(nucleus of the solitary tract,NTS)内GAD67信使核糖核酸(mRNA)及蛋白表达的改变。 (3)应用干湿重法检测LBE对脑干脑水含量改变。应用RT-PCR技术检测LBE对NTS内水通道蛋白AQP4 mRNA表达的改变。应用抗神经元抗体免疫荧光染色技术检测各时间点dmNTS的AQP4蛋白表达的的变化。应用Westernblotting技术,检测LBE对NTS内AQP4蛋白表达的影响。并将AQP4的表达与脑水含量进行相关分析。 (4)应用特异性放射免疫均相竞争分析法(radioimmunoassay,RIA),检测LBE术后大鼠各时间点血浆血管活性物质血管紧张素Ⅱ及心房钠尿肽含量水平,并与血压作相关分析。 4.统计学处理 实验数据用均数±标准差((?)±s)表示。各组间比较采用单因素方差分析和多重比较检验。P<0.05认为有显著性差异。 结果 1.LBE对清醒自由活动大鼠血压及血压调节功能的影响 假手术组各参数与正常组比较无统计学意义。与假手术组相比,LBE术后第1天SBP、DBP、MAP、HR开始下降(P<0.05),第7天降至最低(P<0.01),其数值分别为111.10±10.79 mmHg,70.46±9.98 mmHg,84.00±7.56 mmHg和324.06±18.06 bpm,至21天恢复正常。相反,SBPV、DBPV及HRV则在LBE术后第1天出现显著升高(P<0.01),第7天升至最高点(P<0.01),与假手术组相比分别增加56.65%,69.10%and 40.95%,后逐渐降低,至21天恢复正常。BRS变化趋势与血压、心率趋势相同,与假手术组相比,LBE后第1、7和15天分别降低23.81%,30%和23.53%(P<0.01)。 2.LBE对孤束核背内侧亚核神经细胞病理组织学的影响 透射电镜超微结构观察发现,LBE后神经元细胞膜、内质网、线粒体膜、核膜不清晰、水肿,细胞质少,并出现裂隙、大液泡,核染色深,神经元异染色质显著增多、边集。胶质细胞膜水肿,周围出现空泡变性。髓鞘变性坏死,血管内皮细胞膜水肿,并出现周围裂隙。以LBE7天变化显著。免疫组织化学观察发现LBE后1天Glu免疫组化阳性染色细胞增多,至7天阳性神经元数目最多和染色强度最高,以后逐渐恢复。LBE后1天GABA免疫组化阳性染色细胞即见减少,至7天阳性神经元数目最少,免疫染色强度最低,以后逐渐改善。 3.LBE对孤束核GAD表达的影响 免疫荧光结果显示,假手术组和正常组大鼠dmNTS神经元GAD67蛋白表达无显著性差异。与假手术组比较,LBE组大鼠自术后1天GAD67免疫荧光阳性染色细胞即明显增多,以LBE7天最显著(P<0.01),21天恢复正常。RT-PCR结果显示,LBE术后1天NTS组织就有较假手术组高的GAD67 mRNA表达(P<0.05),7天达到表达的高峰(P<0.01),Sham组和正常组GAD67表达水平相似(P>0.05)。Western blotting结果显示GAD67蛋白的表达与mRNA表达呈现相同的趋势,在LBE术后7天升高94.7%。 4.LBE对脑干脑水含量及孤束核AQP4表达的影响 脑干水含量测定结果显示,正常组和假手术组大鼠脑含水量在各个时点无明显差异(P>0.05)。与假手术组同一时间点相比,LBE组大鼠自术后1天脑组织含水量明显升高,7天达高峰,后逐渐恢复。 免疫荧光结果显示,正常组和假手术组均可见少量AQP4蛋白表达阳性细胞,两者无显著性差异(P>0.05)。RT-PCR及Western blotting结果显示,孤束核部位AQP4的表达,正常组和假手术组相比差别无显著性。在淋巴性脑水肿组,在术后第1天表达水平开始上升(P<0.05),7天达到峰值(P<0.01),21d恢复到正常水平(P>0.05)。脑干脑水含量和AQP4 mRNA及蛋白表达均呈现密切相关关系(mRNA:r=0.9452,P<0.01;蛋白:r=0.8102,P<0.01)。 5.LBE对血浆中AngⅡ及ANP含量水平的影响 与假手术组相比较,LBE大鼠血浆ANP含量显著升高(分别为P<0.05和P<0.01),峰值出现在7天。AngⅡ含量显著降低(分别为P<0.05和P<0.01),谷值出现在7天。正常组和假手术组大鼠血浆ANP和AngⅡ含量在各个时点无明显差异。相关分析显示,AngⅡ和ANP含量与LBE大鼠血压均呈显著正相关(r=0.9584,P<0.01)和显著负相关(r=-0.9103,P<0.01) 1.淋巴性脑水肿可导致清醒自由活动大鼠血压及血压调节功能的降低。 2.淋巴性脑水肿对孤束核背内侧亚核组织结构产生明显的损伤。 3.淋巴性脑水肿上调孤束核背内侧亚核神经的元谷氨酸的表达,下调γ-氨基丁酸及谷氨酸脱羧酶的表达,增加兴奋性氨基酸的神经毒性作用,从而恶化脑损害,最终抑制血压的神经调节功能,血压降低。 4.脑干脑水含量在淋巴性脑水肿大鼠明显增加,并通过上调水通道蛋白-4的表达实现的。 5.淋巴性脑水肿能诱导血管紧张素Ⅱ和心房钠尿肽血浆含量水平的变化,从而实现其血压降低的作用。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R741

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9 何兵;药物治疗肺动脉高压随机对照实验的Meta分析[D];武汉大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 徐洪阁;阴道彩色多普勒超声在多囊卵巢综合征的临床应用分析[D];吉林大学;2011年
2 张洁;1495例眼部肿瘤的彩色多普勒成像分析[D];天津医科大学;2010年
3 董振宇;睡眠障碍成因血流动力学机制的初步研究[D];广西医科大学;2010年
4 柳舜兰;初步探讨三种CDFI参数标准对颈内动脉粥样硬化性狭窄的诊断价值及其影响因素[D];福建医科大学;2012年
5 祝艳秋;彩超探查乳腺主要供血动脉血流参数对乳腺癌诊断价值的研究[D];大连医科大学;2007年
6 刘阳;超声检测系统性红斑狼疮面部血供的研究[D];广西医科大学;2011年
7 王晓曦;冠状动脉局部血流动力学分析及对斑块影响的可行性研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2013年
8 吴淑彬;超声对中心动脉压和脉搏波评价的临床研究[D];第二军医大学;2007年
9 王光美;阻抗心动描记法对急性心肌梗死患者血流动力学参数的临床评价[D];山东大学;2011年
10 曹衡玉;超声探查甲状腺癌主要供血动脉的血流动力学研究[D];广西医科大学;2010年
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