收藏本站
《山东大学》 2008年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

低氧联合p38 MAPK抑制剂SB203580对LPS诱导小鼠巨噬细胞TNF-α表达的影响研究

刘奉琴  
【摘要】: 研究背景及目的 脓毒症(sepsis)是感染、严重创伤及大手术等多种应激状态时的常见并发症。近年随着滥用抗生素使耐药菌增多,介入性治疗及有创性监护增多,以及医院内感染的增多等因素,脓毒症死亡率居高不下,约28%~50%,合并休克及脏器功能不全时可达50%~70%,甚至很快死亡。儿科严重脓毒症和脓毒性休克(septic shock)至今仍处于高发病率、高病死率状态。2002年,国际儿科脓毒症共识会议专家组按严格科学的程序,首次在儿科界确定了脓毒症的相关概念[包括儿科全身炎症反应综合征、感染、脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克和多器官功能障碍综合征(MODS)]。经3年实践,2005年1月发表。严重脓毒症由于病死率高(是美国儿童患病及死亡的主要原因之一)、治疗费用昂贵,已构成对人类健康的严重威胁和经济发展的巨大负担。 革兰阴性菌(G~-)感染是引起脓毒症的重要原因之一,其外膜的活性成分内毒素即脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)与宿主细胞膜上的模式识别受体模式识别受体TLR2和TLR4(toll-like receptor,TLR)结合,启动一系列信号传导反应,引起多种细胞因子和炎症介质的表达和释放。众多实验研究证实前炎症细胞因子TNF-α(tumor necrosis factor-α)是脓毒症和脓毒性休克发病的重要介质,巨噬细胞是脓毒症TNF-α产生的主要来源。大量TNF-α的产生可引起多种细胞因子和炎症介质的过度表达和释放,诱发全身炎性反应,导致血管通透性增加、体液渗出和淋巴细胞移行到炎症部位,影响到心血管、呼吸、血液等多系统的功能。其中,肺是最普遍受影响的器官,脓毒症病人经常发展为急性肺损伤(acute lung injury,ALI)或者急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。肺功能损伤使脓毒症病人必然伴随低氧的病理状态。低氧、低糖、高水平的炎症细胞因子和活性氧代谢产物等是炎症和损伤组织微环境的特点。缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)是哺乳动物和人体内细胞存在着一类介导低氧适应性反应的转录因子,它的氧调节亚单位HIF-1α仅在低氧状态表达,能激活许多低氧反应性基因(hypoxia responsive genes,HRG)的表达。尽管低氧与脓毒症相关,对TNF-α的产生是否与脓毒症低氧过程及HIF-1α诱导相关,这些问题只有很少的研究。 p38 MAPK(mitogen activated protein kinase)被认为是“应激诱导”的MAPK,可在转录和转录后水平调控TNF-α表达,在LPS诱导的TNF-α信号传导通路中占据重要地位,抑制p38通路有希望成为炎症性疾病的新的治疗策略。以SB203580为代表的吡啶异咪哒唑化合物是p38 MAPK的特异性抑制剂,但是对其体内应用效果却仍然存在争议。对氧浓度是否参与p38激活的报道较少见。 本研究通过培养小鼠巨噬细胞RAW264.7和腹腔巨噬细胞,观察在不同氧浓度状态下p38 MAPK的活性和TNF-α分泌水平的改变,同时应用p38抑制剂SB203580进行干预,证实低氧在TNF-α合成中的重要地位。在内毒素血症小鼠模型应用p38抑制剂SB203580治疗,观察小鼠血清TNF-α水平和肺组织HIF-1α蛋白的表达,阐明低氧和HIF-1α在调节脓毒症TNF-α产生的作用机制及其与p38 MAPK通路的关系。 研究方法 1.SB203580对小鼠巨噬细胞系TNF-α产生的抑制效应与低氧和p38 MAPK活性的关系 (1)正常氧状态下SB203580抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞TNF-α产生的剂量关系实验 RAW264.7细胞分别用25μM和10μM SB203580预处理2 h,然后加入LPS10、100及1000 ng/ml,另外一组RAW264.7细胞分别用1-20μM SB203580预处理2h,然后加入LPS 1ng/ml或者用0.2-2μM SB203580预处理2 h,然后加入LPS 0.1ng/ml,正常氧状态下细胞继续孵育18 h,收集上清液。 (2)SB203580在正常和低氧浓度环境下对TNF-α产生的抑制效应实验 RAW264.7细胞培养液加入10μM SB203580培养2 h后加入LPS 1 ng/ml,细胞分别在正常氧、低氧(0.5%O_2)和氯化钴(100μM)模拟低氧环境孵育18 h,收集上清液。 (3)SB203580在正常和低氧浓度环境下对TNF-αmRNA转录活性及mRNA稳定性的影响实验 RAW264.7细胞处理同上,加入LPS培养2 h后,用Trizol方法提取细胞RNA。 另设实验组在加入LPS 2 h后再加入2μg/ml转录抑制剂Actinomycin D,加入Actinomycin D的时间点为0时,在10、30和60 min时间点用Trizol收集细胞RNA。 (4)正常和低氧浓度环境下SB203580抑制效应的动态监测实验 RAW264.7细胞用10μM SB203580预处理2 h,在正常氧和氯化钴(100μM)模拟低氧环境下向细胞培养液中加入LPS 1ng/ml,加入LPS的时间点记为0时,在加入LPS后1、2、4、6、8h收集上清液。 (5)低氧对p38 MAPK及其底物MAPKAPK2活性影响实验 RAW264.7细胞经10μM SB203580预处理2 h后,在正常氧浓度和低氧模拟环境接受LPS 1ng/ml刺激,LPS加入的时间点记为0时,在10、30、60 min收集细胞蛋白质。 2.低氧影响SB203580抑制小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α产生作用的实验 向原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞培养液中加入20μM或10μM SB203580,2 h后加入LPS 1ng/ml或10 ng/ml,细胞在正常氧及氯化钴(100μM)模拟低氧环境下孵育18 h,收集上清液。 以上细胞实验均设无SB203580预处理对照组和溶剂对照组。 3.动物模型实验 (1)正常氧环境下不同剂量LPS对小鼠血清TNF-α水平的影响 小鼠接受腹腔注射0.5-3.5 mg/kg LPS 90 min后处死,留取标本。 (2)正常氧环境和低氧环境下SB203580对内毒素血症小鼠血清TNF-α水平的影响 小鼠接受静脉注射SB203580 15、25 mg/kg,2 h后腹腔注射LPS 0.5 mg/kg,将小鼠置于正常氧环境下或者低氧坏境(10%O_2),注射LPS后90 min处死小鼠,留取标本。 (3)SB203580对内毒素血症小鼠血清TNF-α水平及肺HIF-1α表达的影响 小鼠经静脉注射SB203580 15 mg/kg,2h后腹腔注射LPS 0.5 mg/kg,在注射LPS后90 min和240 min处死,留取血清和肺组织标本。 以上动物实验均设溶剂对照组和生理盐水对照组,每组3只小鼠。 3.实验标本处理方法 (1)酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培上清液和小鼠血清TNF-α水平; (2)Real-time PCR定量检测TNF-αmRNA转录水平; (3)Western blot检测p38 MAPK活性和下游底物MAPKAPK2蛋白表达; (6)RT-PCR和Real-time PCR检测小鼠肺组织HIF-1αmRNA的表达; (7)Western blot检测小鼠肺组织HIF-1α蛋白的表达; (8)免疫组织化学染色(IHC)检测小鼠HIF-1α蛋白在肺组织中的表达及分布情况。 研究结果 1.正常氧状态下RAW264.7对LPS的刺激非常敏感。0.1 ng/ml低剂量至1000ng/ml高剂量LPS均可使RAW264.7细胞产生大量的TNF-α,比未经处理的RAW264.7细胞中TNF-α基本值增加10倍以上。SB203580对LPS诱导RAW264.7细胞产生的TNF-α具有非常明显的抑制效果,可以抑制90%以上TNF-α的产生,并且呈剂量依赖方式,高于SB203580 10μM或1μM的剂量均能有效抑制LPS1 ng/ml或0.1 ng/ml刺激RAW264.7细胞产生的TNF-α,低于这个剂量则对相应LPS刺激产生的TNF-α无明显抑制作用。 2.在无LPS刺激的情况下,低氧(0.5%O_2)或者氯化钴模拟低氧刺激仅使TNF-α的基线值大约升高2倍(p<0.05,n=3)。与正常氧浓度下相比,LPS在低氧浓度状态下刺激TNF-α产生仅有微小的增加(无统计学意义),并且氯化钴具有很好的模拟低氧的效果。SB203580(10μM)不但可以在正常氧浓度下完全抑制LPS诱导的TNF-α产生(p<0.05,n=3),而且可以抑制单独由低氧诱导的TNF-α产生。但是在低氧或者氯化钴模拟低氧状态下观察不到SB203580对LPS诱导的TNF-α蛋白表达的明显抑制作用。 3.SB203580能降低TNF-α在正常氧浓度状态下的转录水平(p<0.05,n=3)。低氧和氯化钴刺激能提高LPS诱导的TNF-αmRNA表达,从而对抗SB203580的抑制作用。 4.低氧状态下LPS刺激TNF-α产生增多和达到峰值水平的时间比正常氧浓度状态下均提早约2 h。SB203580在正常氧浓度状态下可以抑制TNF-α的产生一直维持在基线水平;SB203580在低氧浓度下抑制TNF-α产生的动态曲线与正常氧浓度下LPS单独刺激的诱生曲线平行。 5.Western blot结果显示,在正常氧浓度下,磷酸化有活性的p38 MAPK(p-p38)可在加入LPS后10min检测到,30 min达到峰值状态,60 min有所减弱。在氯化钴模拟低氧状态下可观察到p-p38类似的表达模式。但在不同氧状态下SB203580并没有影响p38和p-p38的表达量。 在正常氧浓度状态下,磷酸化的MAPKAPK2(p-MK2)在接受LPS刺激10min可检测到,30 min检测到p-MK2最大量的表达,60 min表达衰减。低氧状态下p-MK2在30和60 min时间点的表达量比正常氧浓度状态下明显增加,而SB203580对此表达模式没有明显影响。 6.Real-time PCR比较显示低氧可以提高TNF-αmRNA的稳定性。分析TNF-αmRNA在30 min时间点的相对表达量,SB203580在正常氧浓度下并不影响TNF-αmRNA的稳定性(p>0.05,n=3),在低氧状态下可以一定程度的降低其稳定性(p<0.05,n=3)。 7.低氧刺激对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的基线水平没有明显影响(p>0.05,n=3)。LPS在正常氧浓度状态下以剂量依赖方式刺激腹腔巨噬细胞产生TNF-α,在低氧状态下不同剂量LPS的刺激效果没有明显区别(p>0.05,n=3)。小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α受低氧和SB203580影响的的模式与RAW264.7相似,低氧可使SB203580的抑制能力大约降低50%。 8.小鼠在正常氧浓度环境下接受不同剂量LPS 90 min后,血清TNF-α水平与正常对照组小鼠比较均有明显升高(p<0.05,n=3)。 在正常氧浓度和低氧环境下(10%O_2),15 mg/kg和25 mg/kg剂量的SB203580均不能降低0.5 mg/kg LPS诱导的内毒素血症小鼠血清TNF-α水平(p>0.05,n=3)。 小鼠在注射LPS 0.5mg/kg后240 min与90 min急性期比较,血清TNF-α水平有所下降(p<0.05,n=3),24 h基本降至正常水平。 9.小鼠接受LPS注射90 min肺组织中已经可检测到HIF-1αmRNA。Real-timePCR比较发现HIF-1αmRNA的表达水平在SB203580治疗组和对照组之间没有明显差别(p=0.34)。同时Western blot和免疫组化染色均可检测到HIF-1α蛋白的表达。免疫组化染色显示LPS注射90 min后HIF-1α蛋白主要位于在肺间质组织中。LPS注射240 min后,免疫染色阳性的细胞数目减少。与Western blot检测结果一致,SB203580并没有影响HIF-1α蛋白的表达量。 研究结论 1.低氧可以增强p38 MAPK的活性。p38 MAPK的特异性抑制剂SB203580在正常氧浓度下可以完全抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7中TNF-α表达,但在低氧(0.5%O_2或氯化钴模拟低氧)状态下却失去了这种抑制能力。 2.低氧影响小鼠腹腔巨噬细胞对LPS反应和SB203580的抑制效果的模式与RAW264.7细胞相似。 3.低氧可以增强TNF-α的转录活动及mRNA的稳定性。SB203580在正常氧浓度下可以抑制TNF-α的转录,但并不能影响mRNA的稳定性。 4.低氧并不影响p38 MAPK和p-p38 MAPK的表达量,而是通过增强p38的活性,增加下游底物p-MK2的表达,从而增加TNF-α的合成。 5.HIF-1α在内毒素血症模型小鼠肺组织中表达,并且其表达水平不受SB203580的影响。SB203580不能有效降低伴随低氧状态的内毒素血症小鼠血清TNF-α水平。 6.低氧可能通过HIF-1α介导TNF-α的生物合成,并且调节通路不受p38抑制剂的影响,可能与p38通路起到协同作用。 创新及意义 1.本研究阐述了低氧在脓毒症TNF-α生物合成中起重要作用,低氧可提高p38 MAPK的活性,解释了p38抑制剂SB203580在脓毒症及脓毒性休克中具有争议性的体内应用效果。 2.本研究提示HIF-1α可能参与调节TNF-α的生物合成,低氧通过HIF-1α的信号传导可能独立于p38信号通路,并且两条通路有协同作用。我们的发现为理解低氧在脓毒症和脓毒症休克病理过程中的作用提供了新视角。 3.本研究提示在脓毒症和脓毒症休克的临床治疗中,除了TNF-α的生物合成机制,低氧的伴随病理状态也是必须考虑因素之一,为脓毒症的治疗提供了新的靶点和理论依据。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R459.7

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 支娜;陶玲;沈祥春;;大蝎子草水层部位对LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞iNOS与TNF-α的影响[J];中药药理与临床;2010年03期
2 周满红;杜文胜;龙胜双;韩俊红;沈毅;李堂江;;重楼总皂苷对脂多糖诱导大鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α及IL-1β的影响[J];四川中医;2008年03期
3 黄倩;程明军;俞而慨;徐丛剑;;尼古丁对子宫内膜异位症患者腹腔巨噬细胞TNF-α和IL-8分泌的影响[J];现代妇产科进展;2007年05期
4 王建红;武云霞;;盐酸克林霉素对脂多糖刺激人牙周膜细胞分泌TNF-α的影响[J];山西医科大学学报;2009年03期
5 易世红;孙陆果;魏成国;黄红兰;;脂多糖刺激对小鼠腹腔巨噬细胞HMGB1表达的影响[J];中国生物制品学杂志;2009年08期
6 郭建红;杨丽红;;脂多糖对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝细胞凋亡的影响[J];山西医科大学学报;2011年07期
7 杨义武;白海;王存邦;林海;武令启;;异基因大鼠骨髓间充质干细胞对脂多糖刺激活化后小鼠巨噬细胞分泌因子的影响[J];中国组织工程研究与临床康复;2008年34期
8 王世婷;郭竹英;徐芒华;矫强;高丰厚;;重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对脂多糖致大鼠急性肺损伤的保护作用[J];中国临床药理学与治疗学;2009年02期
9 李崇辉,陈明易,刘巨超,臧传波,徐迎新,黄志强;脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞基因表达谱分析[J];中华微生物学和免疫学杂志;2004年10期
10 张申;黄雪梅;卫涛涛;;银杏叶提取物对内毒素诱导巨噬细胞核因子-κB活化及炎性细胞因子表达的调节[J];生命科学研究;2005年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 姚咏明;;严重脓毒症病理生理机制新认识[A];2007年浙江省急诊医学学术年会论文汇编[C];2007年
2 姚咏明;;烧伤脓毒症研究的若干进展[A];浙江省第十七届烧伤外科学学术会议论文汇编[C];2007年
3 唐春燕;管茶香;孙国瑛;周勇;周慧芳;;血管活性肠肽对脂多糖诱导巨噬细胞表达IL-17的影响[A];湖南省首届生理—药理科学青年论坛论文摘要汇编[C];2009年
4 宋卓慧;孙国瑛;周勇;周慧芳;谢辉;彭丽;管茶香;;脂多糖促进巨噬细胞TREM-1 mRNA的表达及其机制[A];中南地区第八届生理学学术大会论文摘要汇编[C];2012年
5 王凤明;胡涛;谭红;周学东;;SB203580对脂多糖抑制牙髓细胞碱性磷酸酶活性的影响[A];2007年第七次全国牙体牙髓病学学术会议论文集[C];2007年
6 朱荻绮;王莹;;小儿肺炎相关脓毒症的临床研究及IL-6、IL-10的意义[A];第六届江浙沪儿科学术会议暨儿科学基础与临床研究进展学术班论文汇编[C];2009年
7 刘旭华;陈煜;段钟平;王泰龄;;D-氨基半乳糖/脂多糖诱导大鼠慢加急性肝衰竭和急性肝衰竭血清TNF-α及肝细胞凋亡的动态变化[A];第一届全国疑难重型肝病大会、第四届全国人工肝及血液净化学术年会论文集[C];2008年
8 朱荻绮;王莹;;小儿严重脓毒症并发MODS[A];第六届江浙沪儿科学术会议暨儿科学基础与临床研究进展学术班论文汇编[C];2009年
9 姚咏明;;严重脓毒症免疫功能障碍及其监测、调理新途径[A];《中华急诊医学杂志》第七届组稿会论文汇编[C];2008年
10 邱泽亮;张宁;宁易平;徐俊龙;楼天正;;间歇性高容量血液滤过对严重脓毒症炎症介质和临床疗效的对照研究[A];首届西湖重症医学论坛暨2011年浙江省重症医学学术年会论文汇编[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 兰克;以尝试用巨噬细胞治瘫痪[N];科技日报;2000年
2 首都医科大学附属北京朝阳医院感染和临床微生物科 曹彬;一例严重脓毒症的临床救治[N];健康报;2011年
3 本报记者  徐亚静;肯定脓毒症概念 探讨中医辨证施治[N];中国医药报;2005年
4 大庆市第一医院儿科副主任 纪树萍衣晓峰 整理;脓毒症有预警信号[N];健康报;2007年
5 唐颖 倪兵 陈代杰;巨噬细胞泡沫化抑制剂研究快步进行[N];中国医药报;2006年
6 张献怀;寻迹金葡菌诱发脓毒症的机制[N];中国医药报;2005年
7 张献怀;寻求治疗创、烧伤的全新思路[N];大众科技报;2005年
8 张献怀;破译脓毒症的密码[N];科技日报;2003年
9 张中桥;白藜芦醇可抑制巨噬细胞释放细胞因子[N];中国中医药报;2007年
10 张献怀;我国创伤脓毒症研究又有新进展[N];大众科技报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘奉琴;低氧联合p38 MAPK抑制剂SB203580对LPS诱导小鼠巨噬细胞TNF-α表达的影响研究[D];山东大学;2008年
2 何建;维拉帕米对大鼠创伤失血性休克复合内毒素血症模型干预机制的初步探讨[D];第二军医大学;2005年
3 杜权;大鼠创伤后巨噬细胞TLR2/4的表达及神经内分泌激素的调节[D];第三军医大学;2008年
4 谭兵;RNA干扰在体外、体内抑制TNF-α表达的实验研究[D];广州医学院;2008年
5 李海龙;核因子-κB炎症信号通路在全身炎症反应时肺泡巨噬细胞过度活化中的作用及Emodin调节作用的实验研究[D];大连医科大学;2006年
6 冯军;治疗严重脓毒症创新药物——活化C蛋白样物质的开发[D];上海医药工业研究院;2005年
7 罗海波;LPS模拟肽疫苗诱导保护性免疫应答的研究[D];第一军医大学;2005年
8 高玉兴;空肠弯曲菌脂多糖成分对周围神经致病机理研究[D];重庆医科大学;2001年
9 张德明;脂多糖结合蛋白多抗对内毒素急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞TLR4信号通路的影响[D];第三军医大学;2003年
10 蒋学风;NAC对感染性早产LPS/NF-κB信号通路及孕激素受体亚型的影响[D];四川大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 贾昭;胆总管梗阻致急性胆囊炎及胆总管梗阻解除后对肿瘤坏死因子-α及胆囊组织中巨噬细胞的研究[D];河北医科大学;2007年
2 周长青;利多卡因对内毒素诱导的大鼠腹腔巨噬细胞HMGB1表达的影响[D];山东大学;2009年
3 陈璐;MAPK信号通路在β-葡聚糖刺激巨噬细胞生成NO和TNF-α中的作用[D];江苏大学;2008年
4 宋建强;胰液反流对家兔急性胆囊炎症影响的实验研究[D];河北医科大学;2008年
5 韩艳萍;膜受体介导的内吞在壳寡糖激活巨噬细胞中的作用[D];浙江大学;2005年
6 范建军;异丙酚对急性肺损伤细胞模型的NF-KB活性的影响[D];山西医科大学;2005年
7 潘建青;雷公藤内酯醇对激活巨噬细胞表达血管活性分子的影响[D];华中科技大学;2006年
8 杨帆;雷公藤多苷对内毒素激活小鼠腹腔巨噬细胞分泌促炎症细胞因子影响的实验研究[D];华中科技大学;2007年
9 张建斌;氯化钴和脂多糖对巨噬细胞RAW264.7表达HIF-1α和TGF-β1的影响[D];苏州大学;2010年
10 杨健;老年原发性高血压患者TNF-α与hs-CRP、Hcy相关性分析[D];山西医科大学;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026