收藏本站
《山东大学》 2008年
加入收藏 获取最新

CD70在肝癌中的表达及其对淋巴细胞增殖抑制作用的研究

吴晗  
【摘要】: 目的: 探讨CD70基因在肝癌中的表达,并对其在肝癌免疫逃逸中的作用进行初步探讨,为阐明肝癌的免疫逃逸机制奠定基础,为寻找肝癌免疫治疗的新靶点提供理论依据。 研究方法: 一.CD70在肝癌中的表达及其克隆表达 1.RT-PCR检测CD70的在肝癌标本和肝癌细胞系中的表达 设计合成针对CD70基因的特异性引物,收集肝癌组织、癌旁组织和肝癌细胞系BEL-7402、HepG2、SMMC-7721细胞,利用Trizol试剂抽提细胞总RNA,经RT-PCR检测CD70 mRNA的表达。 2.真核表达载体PcDNA3-CD70的构建 设计合成针对CD70基因编码区的PCR引物序列:上游引物包含HindⅢ酶切位点,下游引物包含BamHI酶切位点,以BEL-7402cDNA为模板,PCR扩增人CD70基因。PCR产物经HindⅢ、BamHI双酶切,回收后克隆入PcDNA3.0载体。连接产物转化大肠杆菌JM109,LA平板筛选阳性重组子,并经酶切、PCR、DNA测序分析鉴定。 3.高表达真核表达载体PRK-CD70的构建 设计合成针对CD70基因编码区的PCR引物序列:上游引物包含NotⅠ酶切位点,下游引物包含SalⅠ酶切位点,以BEL-7402cDNA为模板,PCR扩增人CD70基因。PCR产物经NotⅠ、SalⅠ双酶切,回收后克隆入PRK载体。连接产物转化大肠杆菌JM109,LA平板筛选阳性重组子,并经酶切、PCR、DNA测序分析鉴定。 4.RT-PCR和Western blot方法检测CD70蛋白表达水平 PcDNA3-CD70、PRK-CD70分别转染肝癌细胞系HepG2,24h后利用Trizol试剂抽提细胞总RNA,经PT-PCR检测CD70mRNA的表达,提取总蛋白,Western blot分析CD70蛋白表达情况。 二.CD70蛋白在肝癌细胞系中对活化淋巴细胞的增殖抑制作用研究 1.CCK8方法检测CD70对活化Jurkat增殖的影响 将真核表达质粒pcDNA3-CD70、PRK-CD70转染肝癌细胞系HepG2(同时设空载体和空细胞对照),转染24h后,与活化Jurkat共培养24h后,加入CCK8试剂,置37℃、5%CO_2孵箱显色1.5h后,酶标仪上测450nm OD值,计算Jurkat增殖抑制率。 2.RT-PCR检测Jurkat细胞活化前后CD27、Siva的表达情况 设计合成针对CD27、Siva基因的特异性引物,分别收集活化前后Jurkat细胞总RNA,经RT-PCR检测CD27、Siva的表达情况。 结果: 一.CD70在肝癌中的表达及其克隆表达 1.RT-PCR检测CD70的在肝癌标本和肝癌细胞系中的表达 10例肝癌组织中3例CD70基因表达呈阳性,2例癌旁组织CD70基因表达均呈阴性。肝癌细胞系Bel-7402,SMMC-7721中CD70基因表达呈阳性,HepG2细胞中CD70基因表达呈阴性。 2.成功构建真核表达载体PcDNA3-CD70 阳性重组子质粒抽提后分别进行连接后单、双酶切、PCR、DNA测序分析鉴定,证明重组载体PcDNA3-CD70构建成功。 3.高表达真核表达载体PRK-CD70的构建 阳性重组子质粒抽提后分别进行连接后单、双酶切、PCR、DNA测序分析鉴定,证明重组载体PcDNA3-CD70构建成功。 4.RT-PCR和Western blot方法检测CD70蛋白表达水平 重组子(PcDNA3-CD70、PRK-CD70)DNA转染HepG2细胞后,RT-PCR和westernblot分别检测到CD70在RNA和蛋白质水平上有表达,并且高表达载体(PRK-CD70)的表达率较PcDNA3-CD70明显升高。 二.CD70蛋白在肝癌细胞系中对活化淋巴细胞的增殖抑制作用研究 1.肝癌细胞系中CD70可显著抑制活化Jurkat细胞的增殖 CCK8结果显示,转染CD70后的HepG2与Jurkat共培养后,Jurkat增殖抑制率与空细胞对照组和空载体对照组相比显著升高。 2.Jurkat细胞活化后CD27、Siva的mRNA表达水平明显升高 RT-PCR结果显示,活化后Jurkat细胞CD27、Siva的mRNA水平较活化前明显升高。 结论及意义: 本研究首次采用PT-PCR检测了肝癌细胞系和肝癌标本中CD70的表达情况。结果显示肝癌细胞系BEL-7402,SMMC-7721中CD70表达呈阳性,HepG2细胞中CD70表达呈阴性。10例肝癌组织中3例CD70表达呈阳性,2例癌旁组织CD70表达均呈阴性。 本研究首次构建了CD70真核表达载体(PcDNA3-CD70),并构建了表达率较高的高表达真核表达载体(PRK-CD70),并检测到其在RNA和蛋白水平均有表达。转染肝癌细胞系HepG2细胞,通过比较转染前后的肝癌细胞对活化的Jurkat细胞增殖的影响,发现转染CD70基因后的肝癌细胞明显抑制了Jurkat细胞的增殖。 有研究指出CD70-CD27可引起活化淋巴细胞的凋亡。CD27和fas一样同属于肿瘤坏死因子受体超家族的成员,但CD27与fas受体不同,CD27的胞浆尾区缺乏胞浆死亡结构域。CD70转导凋亡信号需要借助一种凋亡前体蛋白,Siva。Siva蛋白含有一个类似胞浆死亡结构域的区域,与CD27的胞浆尾区结合传导凋亡信号。本研究采用PHA刺激Jurkat细胞使其活化,分别检测刺激前后Jurkat细胞CD27、Siva的mRNA表达,发现刺激后Jurkat细胞CD27、Siva的mRNA表达水平明显升高。由此可见,被CD70基因抑制的Jurkat细胞可能会有凋亡发生,但这还有待进一步证实。 本研究首次提出了CD70在人肝癌中的免疫抑制作用,为进一步阐明肝癌的免疫逃逸机制奠定了基础,为寻找肝癌免疫治疗的新靶点提供理论依据。
【关键词】:肝肿瘤 CD70 免疫逃逸
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R735.7
【目录】:
  • 中文摘要6-9
  • 英文摘要9-13
  • 符号说明13-15
  • 前言15-17
  • 第一部 CD70在肝癌中的表达及其克隆表达17-41
  • 前言17-18
  • 1 材料18-23
  • 1.1 质粒与菌种18
  • 1.2 细胞18
  • 1.3 主要试剂18-19
  • 1.4 试剂盒19
  • 1.5 DNA分子量19
  • 1.6 PCR引物设计与合成19-20
  • 1.7 其他试剂20-22
  • 1.8 主要实验仪器22-23
  • 2 方法23-37
  • 2.1 RT-PCR检测CD70在肝癌标本和肝癌细胞系中的表达23-25
  • 2.2 重组质粒的构建及鉴定25-35
  • 2.3 真核表达载体PRK-CD70和pcDNA3.0-CD70的体外表达研究35-37
  • 3 结果37-39
  • 3.1 RT-PCR检测CD70在肝癌标本和肝癌细胞系中的表达37
  • 3.2 重组质粒的构建及鉴定37-39
  • 3.3 真核表达载体的体外表达研究39
  • 4 讨论39-41
  • 第二部分 CD70蛋白在肝癌细胞系中对活化淋巴细胞的增殖抑制作用研究41-47
  • 前言41-42
  • 1 材料42-43
  • 1.1 细胞株42-43
  • 1.2 主要试剂43
  • 1.3 PCR引物设计与合成43
  • 1.4 主要实验仪器43
  • 2 方法43-45
  • 2.1 脂质体介导的CD70基因的转染43-44
  • 2.2 CCK8方法检测CD70基因对活化Jurkat增殖的影响44
  • 2.3 RT-PCR检测活化前后Jurkat CD27、Siva的表达情况44-45
  • 3 结果45-46
  • 3.1 CD70在肝癌细胞中的表达对活化Jurkat细胞增殖的影响45-46
  • 3.2 RT-PCR检测活化前后Jurkat CD27、Siva的表达情况46
  • 4.讨论46-47
  • 小结47-48
  • 附图48-57
  • 第一部分 附图48-54
  • 第二部分 附图54-57
  • 附录 质粒物理图谱57-58
  • 参考文献58-63
  • 致谢63-64
  • 发表文章64-65
  • 学位论文评阅及答辩情况表65

【共引文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 贾德刚;鸡包涵体肝炎过程中体液免疫规律的研究[D];内蒙古农业大学;2006年
2 孙国庆;AA肉鸡和农昌Ⅱ号蛋鸡生长发育过程中血液免疫规律的研究[D];内蒙古农业大学;2007年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 马骐;孟令权;葛军;万玉良;姜杉;;Fas/FasL系统与肝癌细胞免疫逃逸的研究进展[J];毒理学杂志;2007年06期
2 王酉;陈莉;李杏玉;邵晓轶;陆牡丹;;人类NET-1基因正、反义真核表达载体的构建及在肝癌SMMC-7721细胞中的表达[J];南京医科大学学报(自然科学版);2007年05期
3 金思思;吴金明;黄智铭;吴建胜;申苏建;;肝癌靶向性AGAP表达载体构建及生物信息学分析[J];温州医学院学报;2010年02期
4 王金志,缪竞诚,盛伟华,杨吉成;ING4基因真核表达载体的构建及其功能[J];解剖学杂志;2005年04期
5 谢锡驹;王锋;;直肠癌中CD70的表达及其对淋巴细胞增殖抑制作用[J];江苏医药;2010年15期
6 唐保东;周奇;林箐华;刘思纯;;塞来昔布对人肝癌细胞增殖的抑制作用[J];南方医科大学学报;2007年10期
7 何伟,张敏,冯献启,刘芳,邹萍;CD80/IgG融合基因重组表达载体的构建及在CHO细胞中功能性表达的研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2005年09期
8 张娇;刘倩;;肝癌Fas/FasL途径免疫逃逸机制及对策[J];中国现代普通外科进展;2006年02期
9 张娇;刘倩;毛海婷;孙琳;;肝癌细胞系Fas/FasL功能与免疫逃逸机制探讨[J];山东大学学报(医学版);2006年03期
10 潘庆敏;肖瑛;付勤烨;;原发性肝癌患者眼部改变的临床研究[J];中国现代普通外科进展;2008年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 丁红;王文平;黄备建;齐青;魏瑞雪;徐智章;;实时灰阶超声造影和螺旋CT诊断肝肿瘤的比较研究[A];中华医学会超声医学新进展学术会议论文汇编[C];2004年
2 洪愉;刘平;周平;;兔VX2肝肿瘤及其转移模型的~(18)F-FDG显像观察[A];中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编[C];2011年
3 熊鹰;孔小云;陈如山;刘新民;金庆文;;复方西黄丸含药血清体外抗癌作用的研究[A];西黄丸临床应用研究论文集[C];2009年
4 郑传胜;梁斌;王勇;周国锋;梁惠民;赵辉;夏向文;熊付;冯敢生;;经导管动脉栓塞对兔VX2肝肿瘤HIF-1α表达的影响[A];第十一次全国中西医结合影像学术研讨会暨全国中西医结合影像学研究进展学习班资料汇编[C];2010年
5 李辉娥;张洁;苏晓萍;张文萍;朱冬香;王梦云;;冷循环超能射频损毁治疗肝肿瘤的护理[A];全国肿瘤护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2002年
6 霍苓;陈敏华;严昆;张晖;杨薇;戴莹;;胆囊旁肝肿瘤射频治疗方法探讨[A];中华医学会超声医学新进展学术会议论文汇编[C];2004年
7 齐青;王文平;魏瑞雪;丁红;黄备建;;SonoVue彩色多普勒超声造影在诊断肝肿瘤中的应用[A];中华医学会超声医学新进展学术会议论文汇编[C];2004年
8 梁斌;郑传胜;王勇;周国锋;梁惠民;赵辉;夏向文;熊付;冯敢生;;经导管动脉栓塞对兔VX2肝肿瘤HIF-1α表达的影响[A];2010湖北省肿瘤介入治疗学术大会论文汇编[C];2010年
9 刘允怡;;肝肿瘤的检查和分期[A];第八届全国肝癌学术会议论文汇编[C];2001年
10 李晓东;王志刚;郑东;冉海涛;张群霞;郑元义;宫琳;;自制包裹氟碳气体的表面活性剂类超声造影剂观察肝肿瘤血流实验研究[A];全国医学影像技术学术会议(CMIT-2004)论文汇编[C];2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 宋全政;真诚守护每一位师生的安全[N];中国教育报;2007年
2 白向忠本报记者 王建梁;一路追着环保走[N];科技日报;2007年
3 本报记者 李德辉 通讯员 王静 实习生 王远;在产学研的广阔海洋纵横驰骋[N];联合日报;2006年
4 记者 宋全政通讯员 周大白 张果红;学生登台讲课 师生田间调研[N];中国教育报;2008年
5 王东;桃李满天下[N];科技日报;2007年
6 本报记者 赵秋丽 通讯员 曹宪忠 冯刚;“文史见长”创优势[N];光明日报;2010年
7 记者 魏海政 宋全政;山东大学泰山学堂多次评价多次流动育英才[N];中国教育报;2010年
8 记者 孙明河魏东;“不辜负人民嘱托,坚决完成任务!”[N];科技日报;2008年
9 特约记者  鲁晓懋;老山东大学:东方瑞士的人文之脉[N];中国房地产报;2006年
10 记者  赵秋丽 通讯员  王秋生;山东大学:推进按大类招生,实施个性化培养[N];光明日报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张娇;人肝癌细胞Fas/FasL途径免疫逃逸机制及其反义寡核苷酸、细胞因子的逆转作用[D];山东大学;2006年
2 曲春媚;蛋白酶体抑制剂MG-132抗人肝癌BEL-7402细胞的实验研究[D];山东大学;2006年
3 韩国庆;熊去氧胆酸对肝癌预防作用的实验研究[D];山东大学;2005年
4 刘君;胃癌血清蛋白质组学及免疫逃逸机制的研究[D];山东大学;2008年
5 许荣华;外源性导入抑癌基因FHIT对肝癌细Hep3B生长的影响[D];华中科技大学;2006年
6 米曰堂;转反义B7-1基因治疗延长大鼠肝移植物存活时间的研究[D];山东大学;2008年
7 刘东兴;维生素D_3类似物ED-71对肝癌预防作用的实验研究[D];山东大学;2007年
8 张文卿;HCMV pp150表达及E1-pp65慢病毒载体刺激T细胞免疫应答的研究[D];山东大学;2006年
9 钟永;人肾癌细胞系干细胞分离及其免疫逃逸机制初步探讨[D];北京协和医学院;2011年
10 邹晓娟;超声引导经皮激光联合无水乙醇消融兔VX2肝肿瘤的实验研究[D];第四军医大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 吴晗;CD70在肝癌中的表达及其对淋巴细胞增殖抑制作用的研究[D];山东大学;2008年
2 李立祥;脂氧合酶抑制剂NDGA对肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的调节作用及其可能机制[D];安徽医科大学;2008年
3 曾燕荣;肝肿瘤血管的多普勒超声检测与病理微血管密度对比研究[D];河北医科大学;2002年
4 曾聪;基质金属蛋白酶9对肝癌细胞TNFRⅠ受体的表达及释放的影响[D];南方医科大学;2009年
5 李文昌;经导管肝动脉化学栓塞术联合脾内注射干扰素治疗大鼠移植性肝肿瘤的实验研究[D];青岛大学;2001年
6 段润卿;转移性肝肿瘤血供及介入治疗中疗效的评价[D];山西医科大学;2005年
7 荆良;肝海绵状血管瘤的治疗探讨[D];第二军医大学;2005年
8 徐瀚峰;雌二醇、uPA及其受体在HCC生物学行为的变化及意义[D];山东大学;2005年
9 夏红;6,8-二—三氟甲基-7-乙酰氧基白杨素活化PPARγ诱导人肝癌Hep G2细胞凋亡研究[D];南华大学;2007年
10 潘泽亚;肝门区肿瘤手术并发症的回顾性分析及防治[D];第二军医大学;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026