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山东地区秋冬型恙虫病流行病学研究

杨丽萍  
【摘要】: 一、研究背景 恙虫病是由恙虫病东方体(Orentia tsutsugamushi,O.tsutsugamushi,Ot)引起的一种自然疫源性疾病。临床上以发热、焦痂或溃病、淋巴结肿大及皮疹为特征。1986年以前,我国恙虫病流行了南方的广大地区,且流行形式主要为夏季型;1986年以来,我国许多北方地区出现了秋冬型恙虫病。 位于长江以北的山东省,1986年9~12月首次在临沂地区的蒙阴县发现恙虫病流行,这也是长江以北第一次发现的恙虫病疫区。1988年山东省济南地区也出现了恙虫病流行,至1996年山东省恙虫病疫区仅局限于临沂和济南两个地区的许多地、市、县。然而,近年来山东省许多其它地区也不断有恙虫病暴发流行的报道,如1996年在济宁市、1997年在烟台的莱州市、2000年在潍坊的青州市都发生了恙虫病流行,且均为首次。2000年9~10月在泰安的肥城市首次发现了65例恙虫病,死亡2例。可见,山东地区自1986年沂蒙山区首次发生恙虫病流行以来,该地区不断有秋冬型恙虫病的发生,新的疫区不断出现。根据山东省恙虫病疫区形成的时间特点,以1996年为界,我们将山东省的恙虫病疫区分为新、老疫区。老疫区是指1986年到1996年山东省首次诊断有恙虫病病例出现的地区;新疫区是指1996年之后首次发现恙虫病流行的地区。由于1990年全国取消了恙虫病的疫情报告制度,从而使该病在山东省全境范围内的流行状况一直不清楚。 二、研究目的 秋冬型恙虫病在山东省部分地区的流行病学研究已取得了一定成果,但仍有许多问题需要我们解决。此次山东地区秋冬型恙虫病的流行病学研究工作,主要围绕着如下几个方面来展开:(1)阐明山东地区恙虫病东方体的基因型别;(2)明确山东地区恙虫病新、老疫区间O.tsutsugamushi核苷酸序列的同源性及进化关系;(3)观察山东地区恙虫病病原体感染鼠脾的超微结构;(4)了解恙虫病在山东省全境的流行现状及特点。 三、研究方法 1.恙虫病的分子流行病学研究 1.1调查点及标本来源选择山东地区恙虫病新、老疫区代表的泰安和临沂地区为调查重点。2004年9月到2006年12月采集临沂和泰安地区临床诊断为恙虫病病人的外周血及焦痂标本;并于山东地区恙虫病流行的秋、冬季,在这两个地区选点捕鼠。 1.2 DNA的提取用酚/氯仿/异戊醇法提取标本中O.tsutsugamushi的DNA。 1.3 Nested PCR根据恙虫病东方体表面蛋白(Ot-Sta)56KDa外膜蛋白基因编码区设计的群、型特异引物,采用PCR技术检测O.tsutsugamushi的DNA,并对其进行分型。 1.4核苷酸序列测定根据Nested PCR分型结果,将群引物扩增的PCR产物纯化、回收后测定O.tsutsugamushi的核苷酸序列。 1.5序列同源性分析和系统发生树分析将所测序列与GenBank中O.tsutsugamushi的核苷酸序列做BLAST比较与分析,并在GenBank中筛选出可用于山东地区O.tsutsugamushi序列分析用的O.tsutsugamushi核苷酸序列。使用MEGA3.1软件的Alignment程序对恙虫病东方体的核苷酸序列进行排序,修去多余碱基,保留O.tsutsugamushi序列分析用的必需区域。应用DNAStar软件的MegAlign程序进行序列同源性分析;采用MEGA3.1软件的Neighbor-joinjing(NJ)法,对所测到的序列与Genbank中部分O.tsutsugamushi的核苷酸序列进行系统发生树分析。 2.恙虫病东方体弱毒株的分离及超微结构研究 2.1 Ot分离用环磷酰胺构建免疫功能低下的动物模型分离山东地区Ot弱毒株,Giemsa染色后,光镜下鉴定Ot。 2.2.基因型鉴定采用Nested PCR技术鉴定分离到Ot的基因型别。 2.3.超微结构研究透射式电子显微镜技术(TEM)研究感染了山东地区Ot弱毒株的鼠脾组织。 3.恙虫病流行现状调查2006年通过山东疾病报告信息系统(ShandongDiseases Reporting Information System,SDRIS)监测了山东省境内恙虫病的发病情况,并在恙虫病流行严重的地区开展了本病临床症状与体征的调查。 四、主要研究结果 1.分子流行病学研究结果 1.1 Nested PCR分型 1.1.1病人标本临沂地区16份病人的12份全血和泰安地区4份病人的3份焦痂标本中检测到了O.tsutsugamushi,均在Kawasaki型引物管中出现了特异的扩增条带。 1.1.2鼠标本临沂地区捕获的128只鼠中,共17只鼠(15只黑线姬鼠、2只大仓鼠)感染了O.tsutsugamushi,且均为Kawasaki型。泰安捕获的68只鼠中,共4只鼠(3只黑线姬鼠、1只小家鼠)为O.tsutsugamushi阳性;其中,除1只黑线姬鼠感染的O.tsutsugamushi未能分型外,其余3只均为Kawasaki型恙虫病东方体。 1.2测序临沂地区恙虫病病人的12份O.tsutsugamushi阳性全血标本,泰安地区恙虫病病人的3份O.tsutsugamushi阳性焦痂及4份O.tsutsugamushi阳性鼠脾的第一次PCR产物,经纯化回收后测序。选取临沂地区部分阳性鼠脾的第一次PCR产物,进行核苷酸序列测定。其中,临沂地区病人全血的WG-2株(Sdu-1)和泰安地区黑线姬鼠的55P株(Sdu-2)的核苷酸序列被NCBI的GenBank收录,其GenBank accession Number分别为DQ489310、EF543196。 1.3 O.tsutsugamushi序列分析 用MEGA3.1软件的Alignment程序对山东地区O.tsutsugamushi分离株与GenBank筛选出的O.tsutsugamushi经碱基排列对齐后,458bp的必需区域可用来做O.tsutsugamushi的核苷酸序列分析。 1.3.1序列同源性临沂地区的16株O.tsutsugamushi和泰安地区7株O.tsutsugamushi的序列同源性为73.9%~100.0%。其中,分离于泰安地区鼠类标本的55P与56P的核苷酸序列同源性是92.5%。其它山东O.tsutsugamushi分离株的序列同源性在99.3%~100.0%之间,属于同一类。另外,55P和56P与其它山东株的同源性为73.9%~76.6%。 1.3.2系统发生树基于Ot-Sta 56KDa基因序列的发生树形成了两大枝。包括Sdu-1株在内的大多数山东地区O.tsutsugamushi分离株,与Oishi、Taguchi、Kanda和Kawasaki等四型首次分离于日本的O.tsutsugamushi分离株处于同一分化枝;且Sdu-1株与这些日本O.tsutsugamushi分离株的核苷酸序列同源性为95.5%~95.9%。分离于台湾的TW461、Hualien-2株,韩国的Yonchon株,中国山西的Sxh951株O.tsutsugamushi位于另一个分化枝。从泰安地区的黑线姬鼠中分离到的56P、55P(Sdu-2)形成了一个独立的分化枝。上述的这三个分化枝构成了系统发生树的一个大枝。O.tsutsugamushi发生树的另一大支又可分为三个分化枝。一个分化枝由分离于泰国的UT177、Karp,韩国的Boryon和日本的Kuroki等O.tsutsugamushi分离株构成。分离自泰国的Kato株处于一个独立的分化枝。泰国的TA716、TA763、TA686三株O.tsutsugamushi形成了第三个分化枝。 2.恙虫病东方体弱毒株的分离及超微结构研究 2.1 Ot分离及基因型成功分离到两株山东地区Ot弱毒株,经Nested PCR鉴定均为Kawasaki型Ot。 2.2 Ot感染鼠脾的透射电镜观察结果TEM电镜下可见形态多样、大小不一、电子密度迥异的Kawasaki型Ot。鼠脾单核细胞的线粒体、粗面内质网等多种细胞器发生了病理改变,核周池发生肿胀、有核周池泡形成。吞噬细胞的胞质中出现了多泡体,在吞噬溶酶体中可见被覆多层膜结构的Ot从内向外推挤溶酶体膜。另外,电镜下经常观察到Kawasaki型Ot的自我吞噬现象。 3.恙虫病流行病学特征 2006年,山东省共有206例恙虫病患者的基本情况登记上报到山东疾病报告信息系统(SDRIS)。所有患者经抗生素治疗有效,无死亡病例发生。 3.1地理分布山东省17个行政区中,济南、青岛、淄博、烟台、潍坊、济宁、泰安、威海、日照、莱芜、临沂、滨州等12个地区均有恙虫病发生。而且,这12个地区均位于山东的沿海地带或黄河以南。山东省恙虫病的总发病率为2.21/百万人口,其中,该病在莱芜和日照地区的发病率较高。另外,52.9%的恙虫病患者出现在临沂和泰安地区,74例患者发生在临沂地区,35例发生在泰安地区。 3.2季节分布山东地区恙虫病主要流行于秋、冬季(八月到十二月),高峰在十月和十一月。另外,春季也有少数病例发生。 3.3年龄、性别、职业分布山东地区恙虫病患者中,年龄最小的2岁,最大的88岁,中位年龄为51岁。大多数患者是成年人,4.85%患者为未成年人。206例恙虫病患者中,男性100例、女性106例。发病人群有农民、工人、学生、退休人员、教师、学龄前儿童和渔民等,其中农民占总发病人数的84.9%。 3.4临床特征恙虫病患者主要的临床症状及体征为,发热(97.9%)、焦痂或溃疡(89.4%)、皮疹(78.7%)和淋巴结肿大(53.2%),但临床表现为轻型。另外,25.5%的恙虫病患者出现脾肿大,19.1%的患者发生头痛,17.0%肝肿大,4.3%患者出现了眼结膜充血。值得注意的是,10.6%的患者发生了间质性肺炎的并发症。 五、结论 1.Sdu-1型Ot是山东地区恙虫病东方体主要的基因型别。从恙虫病患者中成功分离出弱毒的恙虫病东方体,经Nested PCR鉴定为Kawasaki型O.tsutsugamushi。 2.山东地区恙虫病新、老疫区间O.tsutsugamushi的基因变异很少,序列同源性为73.9%~100.0%,处于系统发生树的同一枝。 3.透射式电子显微镜下观察到Kawasaki型Ot的形态学特征及宿主细胞发生的多种病理改变。Ot从吞噬体中逃逸的机制可能为Ot以类似病毒出芽的方式从内向外推挤吞噬体膜得以从吞噬体中逃逸出来。另外,Kawasaki型Ot有自我吞噬的现象。 4.山东恙虫病疫区已波及12个地区,均位于山东的沿海地带或黄河以南。恙虫病的发病人群以农民为主,主要流行于秋、冬季,春季也有少数病例出现。恙虫病患者主要的临床症状及体征为发热、焦痂或溃疡、皮疹和淋巴结肿大。


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