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硒对氟致血管内皮细胞损伤的影响

侯小东  
【摘要】: 目的 研究不同浓度氟对体外培养人脐静脉血管内皮细胞的损伤作用;不同浓度硒对体外培养人脐静脉血管内皮细胞生长的影响;不同浓度的硒对不同浓度氟造成的血管内皮细胞损伤的拮抗作用。为硒拮抗氟致动脉硬化的应用提供理论依据。 方法 人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelialcells,HUVEC)置于37℃,5%CO_2,饱和湿度条件下培养。待细胞处于对数生长期,进行实验。实验分组分为加氟组、加硒组、加氟加硒组。加氟组氟化钠(NaF)浓度分别为0、100、400、700、1000、2000μmol/L。加硒组亚硒酸钠(Na_2SeO_3)的浓度分别为0、50、100、500、1000、2000nmol/L。加硒加氟组氟化钠(400、700、1000、2000μmol/L)+亚硒酸钠(100 nmol/L)。连续培养48h后收集细胞培养液与细胞待用。瑞氏-吉姆萨染色(Wrigh-Giema staining)观测细胞形态,吖啶橙荧光染色(Acridine orang staining)测定细胞凋亡的情况。采用四唑盐(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法测定细胞活性;检测培养液中谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的活性。检测培养液中诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxidesynthase,iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxidesynthase,eNOS)的活性和浓度。采用酶联免疫吸附试验(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)测定培养液中的细胞粘附因子(Intercellularcell adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管粘附因子(Vasular cell adhesionmolecule-1,VCAM-1)的表达。采用逆转录聚合酶连反应(Reversetranscription polymersade chain reaction,RT-PCR)为,测定iNOS-mRNA、eNOS-mRNA的表达。结果采用多组间比较采用方差分析,两两比较采用q检验。 结果 1氟对血管内皮细胞损伤作用 1.1细胞形态学观察 瑞氏-吉姆萨染色发现加氟组细胞随着氟剂量增加数量开始减少,形态变化明显;血管内皮细胞的数量随着浓度增大而减少,内皮细胞中出现似成纤维细胞样改变,,细胞间隙增大。随着NaF浓度增大,变形的细胞所占得比例越大。吖啶橙染色NaF浓度达到2000μmol/L时,细胞核有明显变形,聚集在细胞边缘,呈月牙形排列,并有少许荧光碎片 1.2氟化钠对细胞生长的影响 HUVEC给予NaF处理后48h后,MTT法测定细胞增值,在低浓度NaF,对细胞的生长几乎没有作用(P>0.05),当NaF浓度为700、1000μmol/L时,可以明显抑制细胞得生长(P<0.05)。当浓度为2000μmol/L时抑制的作用更强。 1.3氟对培养液中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响 氟的剂量为100μmol/L时,SOD、GSH-px、MDA的活性或者是浓度都没有显著变化(P>0.05)。随着NaF浓度增大,SOD、GSH-px的活性明显的降低(P<0.05),而MDA的浓度则明显的升高(P<0.05)。 1.4氟对内皮细胞eNOS和iNOS表达的影响 低浓度氟对eNOS影响不大(p>0.05),随着氟浓度增大eNOS的活性逐渐减弱(p<0.01)。而iNOS的活性则随着氟浓度的增高逐渐的增强(p<0.01)。RT-PCR检测细胞eNOS mRNA和iNOS mRNA水平的变化,HUVEC与低浓度氟作用以后,其eNOS和的RT-PCRiNOS产物没有明显变化,但在氟浓度增大后具有统计学意义(P<0.05)。 1.5检测培养液中ICAM-1和VCAM-1浓度 当NaF浓度时,培养液中的ICAM-1和VCAM-1的浓度并没有显著变化(P>0.05)。当氟浓度增大,在400-2000μmol/L时,培养液中两种粘附因子的浓度都明显的增大,统计学检验有显著的统计学意义(P<0.05)。 2硒对血管内皮细胞的影响 通过研究硒对内皮细胞形态、细胞活性、培养液中SOD、GSH-px活性和MDA含量、内皮细胞eNOS和iNOS表达、内皮细胞的ICAM-1和VCAM-1表达的影响,确定硒在浓度为100nmol/L时对细胞明显有保护作用,从而确定硒的干预剂量为100nmol/L。 3硒对氟造成血管内皮细胞损伤的干预作用 3.1硒对氟造成细胞形态改变的影响 细胞在加硒加氟的培养液中培养48 h后染色观察,氟浓度100-700μmol/L细胞形态正常;当加硒加氟组的氟浓度达到1000μmol/L时,出现零星成纤维样细胞,当加硒加氟组的氟浓度达到2000μmol/L时,与加氟组没有明显的改变,细胞形态变化较大,细胞核可见浓染致密并可见荧光碎片 3.2硒对氟造成的细胞活性改变的影响 MTT测定细胞活性在不同组细胞中加入不同浓度的氟和硒共同培养48h后,MTT结果显示,在氟(100-700μmol/L)+硒组时,细胞生长并不受到抑制(P>0.05)。在氟(1000-2000μmol/L)+硒组时,细胞生长明显受到抑制(P<0.05)。但是与只加氟相比,细胞增值都增高。 3.3硒对氟造成内皮细胞培养液中SOD、GSH-PX活性和MDA浓度改变的影响与同剂量加氟组相比,在氟(400-1000μmol/L)+硒组SOD与GSH-Px在培养液中的活性明显的增高(P<0.05),而MDA浓度则明显的降低(P<0.05);氟(2000μmol/L)+硒组,SOD、GSH-Px活性和MDA浓度都没有明显的变化(P>0.05)。 3.4硒对氟造成内皮细胞NOS的异常表达的影响 与同剂量加氟组相比,氟(400,700μmol/L)+硒组培养液中iNOS的活性明显的降低(P<0.05),而eNOS的活性则明显的增高(P<0.05);氟(1000,2000μmol/L)+硒培养液中eNOS和iNOS活性没有明显的变化(P>0.05)。RT-PCR测定结果显示,与同剂量加氟组比较,氟(400-1000μmol/L)+硒组iNOS mRNA表达明显的降低(P<0.05),而氟(2000μmol/L)+硒组iNOSmRNA的表达没有明显的变化;氟(400,1000μmol/L)+硒组的eNOS mRNA表达明显增高(P<0.05),而氟(2000μmol/L)+硒组eNOS mRNA的表达没有明显变化。 3.5硒对氟造成内皮细胞黏附因子异常表达的影响 与同剂量加氟组比较,氟(400-1000μmol/L)+硒组培养液中ICAM-1和VCAM-1的浓度明显降低(P>0.05),氟(2000μmol/L)+硒组培养液中ICAM-1和VCAM-1的浓度则没有明显变化(P>0.05)。 结论 1、高浓度氟可以使内皮细胞的形态发生改变,并且可以导致细胞的调亡;适量剂量硒可以拮抗氟化钠对细胞的损伤。 2、氟可以使培养液中的GSH-Px,SOD活性降低,使MDA的含量增高;适量浓度的硒可以改善这种现象,使SOD、GSH-Px活性明显升高,MDA浓度下降。 3、氟可以抑制eNOS mRNA的表达,使培养液中的eNOS活性降低;可以刺激iNOS mRNA的表达,使培养液中iNOS活性增强;适量浓度硒可以抑制氟对细胞eNOS和iNOS的刺激,使eNOS和iNOS的表达和活性趋于正常。 4、氟可以激活内皮细胞的粘附因子的表达,使培养液中ICAM-1和VCAM-1的含量增高;适量浓度硒可以抑制氟对细胞黏附因子的刺激,使其在培养液中的浓度明显的低于只加氟的实验组


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