普罗布考对氧化诱导的血管平滑肌细胞增殖和凋亡的研究

【摘要】： 研究背景:心脑血管疾病如动脉粥样硬化是常见病、多发病,发生机制及其复杂,目前仍未完全阐明,其中血管平滑肌细胞(VSMC)在活性氧(ROS)、炎症介质和细胞因子等因素刺激下过度增殖或发生凋亡,可能是动脉粥样硬化病变形成、粥样斑块破裂以及介入损伤后血管再狭窄的主要机制之一。VSMC发生增殖或凋亡受细胞内氧化还原平衡状态的影响和调控,细胞中两大还原系统之一硫氧还原蛋白(Trx)系统中,Trx-1是重要的促生长辅助因子,具有抗细胞凋亡活性,另一还原系统谷胱甘肽(GSH)系统中,GSH具有抗氧化、调节细胞增殖、调控氧化还原敏感的信号转导等多种生理功能,细胞内GSH和Trx-1浓度变化影响细胞内氧化还原环境,发挥调节细胞凋亡或增殖作用。 普罗布考是二十世纪七十年代人工合成的降脂药,近年来,随着人们对氧化损伤在动脉粥样硬化发病机制中作用的认识和抗氧化作用机制研究的深入,普罗布考与细胞内信号蛋白和转录因子活性之间的关系对VSMC增殖与凋亡的影响及其在动脉粥样硬化斑块稳定性和介入损伤后血管再狭窄中病理机制中的作用,已成为近来研究的热点。本研究观察了普罗布考对氧化诱导的VSMC增殖和凋亡的作用及对信号蛋白通路中ERK1/2、MKP-1、HO、和ASK-1的影响,揭示普罗布考的双重作用机制,为临床应用提供理论依据。 实验方法:本实验采用组织贴块法原代培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),普罗布考选用100μmol·L~(-1),10μmol·L~(-1),1μmol·L~(-1)三个浓度组,进行两方面实验: 1.普罗布考对ox-LDL诱导的VSMC增殖的影响及信号转导机制 (1)采用MTT法和胎盘蓝染色法检测不同浓度ox-LDL在不同时间点对VSMC增殖的影响,确定ox-LDL诱导细胞增殖的最佳浓度和最佳时间。 (2)选用ox-LDL最佳促增殖浓度诱导VSMC,加入普罗布考高、中、低剂量,采用GSH和GSSG含量检测试剂盒计算细胞内GSH/GSSG比值变化,采用Western blotting方法检测细胞内Trx-1浓度变化,观察普罗布考对ox-LDL诱导的VSMC细胞内氧化还原状态的影响。 (3)以MTT法评价其对VSMC的细胞活力影响;以碘化丙啶(PI)染色结合流式细胞术检测细胞周期,评价普罗布考对VSMC周期各时相的影响;MTT法测定一周内细胞活力变化,绘制细胞生长曲线,观察普罗布考对ox-LDL诱导的VSMC生长抑制作用;采用划痕实验,评价普罗布考抑制VSMC迁移的作用。 (4)以western blot方法检测VSMC细胞内ERK1/2、p-ERK1/2、MKP-1、HO-1和Trx-1蛋白表达变化,探讨普罗布考抑制ox-LDL诱导VSMC增殖的分子机制。 2.普罗布考对H_2O_2诱导的VSMC凋亡及信号转导的影响 (1)采用MTT法和Annexin V/PI双染色法检测不同浓度H_2O_2对VSMV凋亡的影响,确定H_2O_2诱导细胞凋亡的最佳浓度。 (2)选用H_2O_2最佳促凋亡浓度诱导VSMC,加入普罗布考高、中、低剂量,采用GSH和GSSG含量检测试剂盒计算细胞内GSH/GSSG比值变化,采用Western blot方法检测细胞内Trx-1浓度变化,观察普罗布考对H_2O_2诱导的VSMC细胞内氧化还原状态的影响。 (3)以MTT法评价其对VSMC细胞存活力的影响;Hoechest 33258荧光染色法观察普罗布考对凋亡细胞形态的影响;以Annexin V/PI双染色法定量分析VSMC凋亡百分率的影响;DNA末端原位凋亡染色法(TNNEL)检测细胞原位凋亡计数细胞凋亡指数,评价普罗布考对凋亡细胞形态及凋亡率的影响。 (4)以western blot方法检测VSMC细胞内ASK-1和Trx-1蛋白表达水平变化,探讨普罗布考抑制ox-LDL诱导VSMC增殖的分子机制。 实验结果: 1.普罗布考对ox-LDL诱导的VSMC增殖及信号转导的影响 (1)MTT法检测ox-LDL浓度为35 mg.L~(-1)、与细胞接触时间为48h时对VSMc的促增殖能力最显著(P＜0.01),随着时间延长,ox-LDL的促增殖作用逐渐减弱。确定采用35mg.L~(-1)ox-LDL,与细胞接触时间为48h时为实验条件。 (2)ox-LDL 35mg.L~(-1)与细胞共同孵育48h,细胞内GSH/GSSG的比值与对照组相比较轻度下降,加入普罗布考高、中、低剂量共同孵育,细胞内GSH/GSS比值呈浓度依赖性升高,Trx-1的表达显著增强。 (3)ox-LDL35mg.L~(-1)与VSMC孵育诱导细胞增殖,加入普罗布考后,MTT检测细胞的吸光度值显著下降(P＜0.01);通过流式细胞术检测细胞周期发现,普罗布考能使ox-LDL刺激的VSMC停滞于G0/G1期、S期,阻止其进入G2/M期,作用随浓度的增加而增强,并且在G0/G1期前,出现明显的亚二倍体峰(凋亡峰);ox-LDL可刺激VSMC增殖(P＜0.05),加普罗布考后细胞生长明显减缓;普罗布考可以明显抑制ox-LDL刺激的VSMC增殖和迁移。 (4)通过western blot实验发现普罗布考可明显抑制p-ERK1/2表达,并显著增强MKP-1表达;使还原型Trx-1和HO-1表达明显增强,与ox-LDL刺激组相比均具有显著性差异(P＜0.05),并呈现浓度依赖关系。 2.普罗布考对H_2O_2诱导的VSMC凋亡及信号转导的影响 (1)MTT法检测H_2O_2浓度为1000μmol.L~(-1)、与细胞接触时间6h细胞存活力明显下降,与对照组比较具有显著性差异(P＜0.01);Annexin V/PI双染流式细胞术结果显示,H_2O_21000μmol.L~(-1)刺激细胞后细胞早期凋亡率与对照组比较明显升高,诱导细胞凋亡作用明显(P＜0.01)。确定采用H_2O_21000μmol.L~(-1),作用6h为实验条件。 (2)H_2O_21000μmol.L~(-1)细胞共同孵育6h,细胞内GSH/GSSG的比值与对照组相比显著下降(P＜0.01),加入普罗布考高、中、低剂量共同孵育,细胞内GSH/GSSG的呈浓度依赖性升高;以western blot分析发现H_2O_2刺激后Trx-1蛋白表达抑制作用明显,加入普罗布考后Trx-1的表达显著增强。 (3)H_2O_21000μ.L~(-1)与细胞孵育6h,MTT法检测其细胞OD值明显下降,加入普罗布考高、中、低剂量共同孵育后,其OD值升高。通过Hoechest 33258荧光染色法发现,H_2O_2可促使VSMC细胞凋亡,荧光显微镜下见细胞呈浓染致密荧光,荧光强度大,对照组细胞呈现均匀弥散的荧光,强度弱。加入普罗布考后,核浓染的细胞数减少,并呈现浓度依赖性降低;通过流式细胞术检测发现,H_2O_2刺激后细胞的凋亡率明显增加(P＜0.01),而不同浓度的普罗布考处理后,细胞凋亡率呈现浓度依赖性降低;TUNEL法实验发现,正常对照组的细胞核多为椭圆形或圆形,呈均一的蓝染,无明显的凋亡细胞,H_2O_2处理组细胞核呈棕褐色着色,核固缩,染色质聚集成团,呈现强阳性改变,普罗布考处理组棕黄色染色的细胞核减少。 (4)1000μmol.L~(-1)H_2O_2处理VSMC后,与正常对照组相比,细胞ASK-1蛋白表达明显增强,Trx-1蛋白表达降低,而普罗布考处理可以减少细胞中ASK-1蛋白的表达,增加Trx-1的表达,呈浓度依赖性。 结论:35mg.L~(-1)的ox-LDL可诱导VSMC增殖,使细胞内的GSH/GSSG比值轻度下降,其促增殖作用与MKP-1活性受抑制,ERK1/2活性增强有关;普罗布考可以通过增强MKP-1的蛋白表达,从而抑制ERK1/2活性,发挥抗增殖作用;尚可通过增强Trx-1的蛋白表达,增强HO-1活性,诱导VSMC凋亡,从而发挥抗增殖作用;1000μmol.L~(-1)H_2O_2能够诱导VSMC凋亡,使细胞内GSH/GSSG比值显著下降,Trx-1表达同步下降,其促凋亡活性与Trx-1浓度降低和ASK-1表达增加有关。普罗布考能够通过增加GSH/GSSG比值,减轻Trx-1浓度的降低,从而抑制ASK-1活性,发挥抗凋亡作用。

【关键词】：普罗布考 氧化损伤 增殖 凋亡 信号转导
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R96
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