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《山东大学》 2009年
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多硫酸化磷酸甘露寡糖的制备及其抗肿瘤血管生成作用的研究

张云峰  
【摘要】: 肿瘤生长是血管依赖性的,肿瘤通过分泌各种因子促进内皮细胞的增殖和毛细血管的形成,而新生血管通过营养控制着肿瘤的生长。此外,肿瘤血管生成在肿瘤从良性向恶性的转变、肿瘤细胞进入血液循环、转移灶的发展中都起着重要的作用,涉及肿瘤形成到转移的全过程。在肿瘤血管生成过程中,需要多种血管生成相关因子的参与,其中VEGF、bFGF、MMP-2等在肿瘤血管生成的过程中起到重要的促进作用。因此,通过影响VEGF、bFGF、MMP-2等的水平从而抗血管生成已成为抗肿瘤治疗新的研究热点。 糖类作为构成生命的基本物质之一,参与许多重要的生命活动,目前发现的具有生物活性的糖类已有上百种,对其结构和功能的研究越来越多,其中糖类的抗肿瘤活性研究最多,且其作用机制多样,如调整肿瘤细胞的细胞膜流动性、影响肿瘤细胞的信号转导通路、诱导肿瘤细胞的凋亡、干扰肿瘤的血管生成以及从肿瘤原发灶向周围组织的侵袭和转移等。同时,许多研究发现经过修饰后的糖类衍生物,由于其结构的改变,生物活性也有显著的增强。 因此,本实验以毕赤酵母发酵产物胞外多糖为原料,对其温和酸水解,对得到的寡糖混合物进行硫酸化修饰并加以分离,制得不同分子量分布的多硫酸化甘露寡糖PSPMOS,用CAM对各组分进行抗血管生成筛选,并对活性寡糖进行结构分析;为了探讨其潜在的抗肿瘤血管生成活性,本实验在体外检测了PSPMOS对肿瘤细胞血管生成相关生长因子VEGF、bFGF、MMP-2的作用,在体内考察PSPMOS对肿瘤血管生成相关因子VEGF、MMP-2、MVD表达的影响。 本研究取得的结果和结论有一下几个方面: 1 PSPMOS的分离制备 复苏、培养毕赤酵母NRRL Y-2448并利用其进行发酵,得到胞外粗多糖PMP,利用苯酚-硫酸法测定其总糖含量为(89.17±1.64)%;采用TLC和GC确定PMP的单糖组成为甘露糖。通过稀盐酸降解PMP,利用超滤的方法对水解产物进行初步分离得到寡糖混合物MOS,然后利用DFF离子交换层析对MOS进行分离,选取其中的磷酸寡糖(PMOS)并对其进行硫酸化修饰得到多硫酸化寡聚糖混合物PSPMOS,并利用Bio-gel P6凝胶层析对PSPMOS进行进一步的分离,得到分子量较为单一的寡糖组分PSPMOS-1、PSPMOS-2、PSPMOS-3、PSPMOS-4,PAGE结果显示四种寡糖组分为电泳纯。此外,还利用玫瑰酸钠法和改良的Fiske-Subbarow定磷法确定了PSPMOS的硫酸根含量和磷酸根含量分别为(42.84±0.87)%和(6.91±0.087)%,高效液相色谱测定了PSPMOS的分子量为2058Da。 2具有抗血管生成作用PSPMOS的筛选 用CAM模型对分离得到的四种寡糖组分进行抗血管生成作用筛选,筛选结果显示,仅PSPMOS-3具有抗血管生成作用,将筛选得到的活性组分PSPMOS-3进行结构分析和抗肿瘤血管生成作用研究。 3 PSPMOS-3的结构研究 利用紫外扫描光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(ESI-MS)、核磁共振光谱(~1H-NMR、~(13)C-NMR)分析结果确定PSPMOS-3分子结构。UV结果显示,PSPMOS-3不含有核酸、蛋白质等杂质;IR结果显示,PSPMOS-3为分子结构中含有硫酸基团取代的甘露寡糖,其甘露糖单元为α-构型,且糖单元之间多以α-糖苷键相连接;ESI-MS结果显示,PSPMOS-3为分子结构中有一个磷酸基团和五个硫酸基团取代的甘露五聚糖(Mr 1462 Da);NMR结果显示,PSPMOS-3分子结构中的各个糖单元之间以α1→3相连接,但还原末端的两糖单元之间是以α1→2相连接,且还原末端的C_1、中间糖单元的C_6位上的羟基被硫酸化了,而非还原末端糖环的C_6上的羟基被磷酸化了,C_2羟基发生了硫酸化。 4 PSPMOS-3对脐静脉内皮细胞和肿瘤细胞生长因子的作用 采用MTT法测定了PSPMOS-3对HUVEC增殖的影响,划痕法考察了PSPMOS-3对HUVEC迁移的作用;采用MTT法测定了PSPMOS-3对人卵巢癌SKOV3细胞生长的抑制作用,并用台盼蓝排染实验判断PSPMOS-3对SKOV3细胞的作用是否为细胞毒作用。结果显示,不同浓度的PSPMOS-3可明显抑制HUVEC的增殖,并能抑制HUVEC的迁移,PSPMOS-3对SKOV3细胞增殖具有较弱的抑制作用,台盼蓝实验显示PSPMOS-3对SKOV3细胞的抑制作用非细胞毒作用。 5 PSPMOS-3对肿瘤细胞生长相关因子的作用 利用VEGF-ELISA试剂盒、bFGF-ELISA测定不同浓度的PSPMOS-3对人卵巢癌细胞SKOV3分泌VEGF、bFGF的影响,结果显示:不同剂量的PSPMOS-3对VEGF、bFGF的分泌均具有不同程度的下调作用,且具有一定的剂量依赖性,其中,PSPMOS-3抑制SKOV3分泌VEGF的IC_(50)为(26.64±1.57)μg/mL(24 h)、(14.82±1.92)μg/mL(48 h)、(12.28±2.09)μg/mL(72 h),抑制SKOV3分泌bFGF的IC_(50)为(73.07±4.24)μg/mL(24 h)、(29.77±3.11)μg/mL(48 h)、(22.13±2.15)μg/mL(72 h);利用Western Bloting检测MMP-2的表达水平,结果显示,PSPMOS-3对MMP-2表达具有一定的抑制作用,并呈现量效依赖关系。 6 PSPMOS-3对CAM血管生成和小鼠H_(22)肿瘤血管生成相关因子表达的影响 利用CAM实验考察不同浓度PSPMOS-3对CAM血管生成的作用,结果显示,不同浓度的PSPMOS-3能抑制CAM的血管生成,并呈现一定的剂量依赖性;昆明种小鼠腋下接种H_(22)肿瘤,给予不同剂量的PSPMOS-3,结果显示,不同剂量的PSPMOS-3能够抑制肿瘤的生长,低、中、高低剂量组的抑瘤率分别为15.43%、36.01%、43.43%;处死小鼠,对肿瘤组织进行HE染色,并用免疫组化法考察了肿瘤组织中VEGF、MVD、MMP-2的表达情况,结果显示,PSPMOS-3能促进肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡,减少肿瘤血管的生成,并能下调肿瘤血管生成相关因子VEGF、MMP-2的表达,减少肿瘤组织中的MVD。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R94;R96

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