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《山东大学》 2009年
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肥大细胞类胰蛋白酶在瘢痕疙瘩中的定位和表达

高峰  
【摘要】: 目的 瘢痕疙瘩是皮肤损伤后纤维组织过度修复的产物,具有一定的良性肿瘤的特征,过度增生并超过初始创伤的边界,瘢痕疙瘩的发病机制复杂,尽管皮肤的创伤和感染是公认的发病原因,具体的发病机制仍然未知。正常的创面修复需要胶原纤维增生和基质降解之间的巧妙平衡,但是瘢痕疙瘩的胶原合成量明显高于增生性瘢痕,而且瘢痕疙瘩存在着胶原纤维的降解不足。 肥大细胞类胰蛋白酶(mast cell tryptase,MCT)是一种中性丝氨酸蛋白酶,以活性形式储存在肥大细胞分泌颗粒中,在肥大细胞脱颗粒过程中被释放到细胞的周围并在局部产生相应的生物学作用。MCT是肥大细胞最主要的蛋白酶,约占其细胞蛋白总量的25%,基因定位于人16号染色体的短臂末端,其活化形式为一个约140KD大小的四聚体。研究发现MCT能够促进表皮成纤维细胞增殖和α1型前胶原合成,提示可能与瘢痕疙瘩的形成有一定关系。 我们将应用免疫组化的方法确定MCT在瘢痕疙瘩中是否有表达及表达的位置,在应用实时荧光PCR方法确定MCT基因在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及正常皮肤中是否存在差别。根据以上的结果我们就能够结合MCT的生物学特性,探讨MCT在瘢痕疙瘩的形成过程中是否有一定的作用及其可能的作用机制。 资料与方法 一.临床资料 瘢痕疙瘩,20例,来自于20个患者,年龄15到32岁,瘢痕形成时间1到4年;增生性瘢痕,20例,来自于20个患者,年龄10到45岁,瘢痕形成时间6个月到2年;正常皮肤,20例,来自于20个患者,年龄8到30岁。标本全部由山东大学附属山东省立医院烧伤整形科提供,根据临床表现和病理结果[42-46]分类。瘢痕及皮肤均无感染、无皮肤病变,手术切除前未接受激素、放射等治疗。标本切取后立即放入液氮中保存备用。 二.方法 1.荧光免疫组化 当瘢痕组织中有MCT表达时,MCT抗体(一抗)将于MCT结合。再用荧光标记的二抗与一抗结合,就能够在荧光显微镜下观察到二抗的位置,也就是MCT的位置。 2.实时荧光相对定量pcr (1)提取瘢痕组织中的RNA。 (2)反转录并扩增MCT的基因。 (3)然后应用实时荧光半定量pcr方法观察MCT在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及正常皮肤中是否存在差异。相对定量分析MCT在这三者之间的表达倍数关系。 三.统计学方法 本实验应用相对定量的C_T值比较法,7500PCR仪系统软件将根据扩增过程中荧光信号的变化情况来设定相关参数并计算样本中基因的相对含量,再应用SPSS10.0的F检验对相对含量值进行数据统计分析。 结果 一.荧光免疫组化 荧光显微镜下,在瘢痕疙瘩中可见较强的而且多的荧光信号,主要集中在胶原纤维束之间,以真皮浅层较多。在增生性瘢痕和皮肤中只有较少或者较弱的荧光信号。 二.实时荧光相对定量pcr 统计学证实瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及皮肽三者之间在MCT基因表达上存在统计学差异(P<0.01)。在瘢痕疙瘩中的MCT基因量约为增生性瘢痕的2.5倍、皮肤的5.4倍,而增生性瘢痕中MCT基因量约为皮肤的2.13倍。 结论 本实验发现MCT基因在皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩之间存在递增的梯度变比趋势及表达倍数关系。这与我们的预期结果相一致,也写以前研究发现的MCT在纤维化组织中的高表达结果相一致免疫荧光组化又发现MCT主要定位于瘢痕疙瘩的真皮浅层胶原纤维束之间,而Ghildyal N等发现MCT释放后主要作用于其周围局部组织,以前的研究发现MCT能够促进降解纤连蛋白等细胞外基质,还能够促进成纤维细胞的增生。因此我们认为,MCT可能通过在真皮浅层降解细胞外基质屏障和促进某些成纤维细胞的增生两种方式在瘢痕疙瘩的形成中起到了一定的作用。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R622

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