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《山东大学》 2009年
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头颈部鳞状细胞癌中表皮生长因子受体的表达、单核苷酸多态性及基因表达调控的初步研究

金童  
【摘要】: 头颈部鳞状细胞癌(Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck,SCCHN)指发生于口腔、咽、喉、鼻腔、鼻窦、唾液腺、颈段气管及食管的鳞状细胞癌,其组织来源于上呼吸消化道的粘膜上皮细胞。2003年统计SCCHN每年在世界范围内大约有540,000例新发病例,其中可造成271,000例死亡病例,死亡率超过50%。由于SCCHN具有局部浸润生长、易原位复发及远处转移的特点,目前其治疗仍然是一个富有挑战性的临床课题,其发病率及死亡率较高。虽然外科手术、放射治疗及辅助化疗等治疗方法的综合应用在一定程度上提高SCCHN患者生存率,但大部分研究表明其晚期患者5年生存率仍仅在30%和40%之间。因此研究SCCHN发生过程中的分子生物学机制,对于SCCHN的早期诊断以及为SCCHN的治疗提供新靶点具有重要意义。 表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)是一种分子量为170 kDa的糖蛋白,其编码基因位于染色体7p12,包含28个外显子,属于ErbB受体家族。EGFR的活化可以抑制细胞凋亡,促进细胞增殖和血管形成。其异常活化可导致细胞异常增殖及其他促进肿瘤增长的反应,并可增加肿瘤细胞恶性转移的潜能。研究表明在多种上皮源性肿瘤包括SCCHN中均存在EGFR的表达异常,其中大部分表现为EGFR的过表达,其表达可能与SCCHN的预后密切相关,因此EGFR基因被视为可能的SCCHN治疗的新靶点。已有研究表明,EGFR的表达受多种转录因子如p53、Sp1等的调控,探讨SCCHN中EGFR基因的表达调控对于进一步了解SCCHN的发生机制、为SCCHN治疗提供新的作用靶点具有重要意义。目前对EGFR基因的表达调控研究主要局限于EGFR 1号内含子及其上游几百碱基的范围,较大范围的调控机制少见于文献。近几年EGFR基因突变和单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)与肿瘤发生发展的关系也成为研究热点,目前的研究主要集中于该基因的18、19、20及21号外显子,这些外显子编码EGFR酪氨酸激酶活性区的ATP结合域,是影响EGFR激酶活性的关键区域。研究表明在非小细胞肺癌中约10~15%的患者存在上述关键区域的基因突变,该突变增强了非小细胞肺癌对某些EGFR抑制剂如gefitinib的治疗反应。这表明基因水平的突变引起该基因表达产物的变化,尤其是在某些关键区域的变化可以影响该区域的功能。因此可以预见,如果在SCCHN中检出上述EGFR基因关键区域的突变,对EGFR成为SCCHN治疗靶点,以及拓展gefitinib等EGFR抑制剂的治疗范围有重要意义。同时,EGFR基因的SNP和SCCHN的关系也引起了研究者的关注。SNP指的是DNA序列上发生的单个核苷酸碱基之间的变异,在人群中这种变异的发生频率至少大于1%,否则被认为是点突变。以往的研究表明基因多态性是一种可以用于预测SCCHN进程的标记。然而,到目前为止,有关中国SCCNH患者中EGFR基因酪氨酸激酶区域(18~21号外显子)突变或SNP的发生率及其与临床病理指标间的关系,尚无报道。 因此,研究SCCHN中EGFR基因表达、关键外显子的突变或单核苷酸多态性与临床病理指标间的关系,并进一步分析其基因表达调控机制,有助于深入理解SCCHN发生的分子机制,对于SCCHN的分子靶向治疗有指导意义。本研①利用PCR技术检测了中国SCCHN患者新鲜组织标本中EGFR的表达改变,分析了EGFR表达与临床病理指标及预后的关系;②通过PCR及直接测序的方法证实在中国SCCHN患者中存在EGFR外显子的单核苷酸多态现象,并分析了其与临床病理指标及预后的关系;③克隆了人EGFR基因上游2875 bp的启动调控区片段,利用瞬时转染、报道基因分析、缺失突变分析、RT-PCR、Western blot等方法研究了该区域的启动子活性,并对该区域的顺式作用元件进行了初步分析。 第一部分头颈部鳞状细胞癌中EGFR表达与临床病理指标及预后的关系 【研究目的】 研究头颈部鳞状细胞癌患者肿瘤组织中EGFR表达改变及其与临床病理指标及预后的关系。 【研究方法】 ①收集96例原发SCCHN肿瘤组织,并收集距肿瘤切缘1 cm以上部位的形态学正常的粘膜组织作为对照。 ②TRIzol法分别提取肿瘤组织和正常粘膜组织中的总RNA,反转录成cDNA。根据EGFR基因组序列合成EGFR特异性引物,以5S RNA为内参照,通过PCR检测肿瘤组织和正常粘膜组织中EGFR表达水平的差异。 ③应用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析。卡方统计分析EGFR表达与临床病理指标间的关系,非参数统计应用于不适用卡方统计者;Kaplan-Meier生存率分析及Cox回归模型绘制生存率曲线并分析预后,无病生存期的计算采取自诊断之日起至明确证明发生局部复发、远处转移或死亡的时间。所有的统计分析均为双侧,取P<0.05为有统计学意义。 【结果】 ①在96例SCCHN临床标本中,74例(77.1%)肿瘤组织对比其临近的形态学正常的组织出现EGFR表达异常;其中47例(49.0%)过表达,27例(28.1%)低表达。 ②EGFR表达与性别、肿瘤大小(T分期)、颈部淋巴结转移(N分期)及饮酒无关(P>0.05);与年龄(P=0.001)、肿瘤的原发部位(P=0.000)、组织分化程度(P=0.016)、临床分期(P=0.030)及吸烟有关(P=0.034)。 ③EGFR的过表达主要发生于年龄小于60岁的吸烟者、原发于口咽或喉咽部的肿瘤、中低分化的肿瘤及临床分期Ⅲ-Ⅳ期的SCCHN患者。 ④生存率分析表明EGFR表达与SCCHN的预后无关(P>0.05),目前数据并不支持其作为SCCHN患者独立的预后因素(P>0.05)。 【结论】 ①在SCCHN患者肿瘤组织中存在EGFR的表达异常。 ②过表达EGFR的SCCHN多原发于喉咽及口咽部。 ③吸烟可能引起EGFR的表达增加。 ④EGFR是SCCHN发生及发展过程中的重要影响因子,起到了癌蛋白的作用; 第二部分头颈部鳞状细胞癌中EGFR基因18~21号外显子单核苷酸多态性的研究 【研究目的】 研究中国头颈部鳞状细胞癌患者EGFR基因第18~21号外显子中是否存在突变或单核苷酸多态现象,并进一步研究及其与临床病理指标及预后的关系。 【研究方法】 ①收集96例原发SCCHN肿瘤组织,并收集距肿瘤切缘1cm以上部位的形态学正常的粘膜组织作为对照。 ②提取肿瘤组织及正常粘膜组织中的基因组DNA。根据EGFR基因第18、19、20、21号外显子序列分别设计引物,进行PCR扩增,凝胶电泳回收上述四条外显子目的带,双向测序,检测其是否存在基因突变或单核苷酸多态现象。 ③应用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析。两样本率的比较采用u检验;卡方统计分析测序结果临床病理指标间的关系,非参数统计应用于不适用卡方统计者;Kaplan-Meier生存率分析及Cox回归模型绘制生存率曲线并分析预后,无病生存期的计算采取自诊断之日起至明确证明发生局部复发、远处转移或死亡的时间。所有的统计分析均为双侧,取P<0.05为有统计学意义。 【结果】 ①对EGFR基因18~21号外显子的DNA测序表明,在中国SCCHN患者中EGFR基因18~21号外显子未发现明显突变;22例(22.9%)患者的20号外显子存在单核苷酸多态性(SNP),其第78号位点的鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)取代。密码由CAG变为CAA,相应的氨基酸(谷氨酰胺)并没有改变。这表明这是一个同义的单核甘酸多态(Synonymous Single Nucleotide Polymorphism,sSNP)。 ②上述22例患者EGFR基因20号外显子单核苷酸多态均为G/A杂合。 ③中国SCCHN患者中EGFR基因20号外显子G/A杂合sSNP出现率与GeneBank正常亚洲人的数据之间有统计学差异(P<0.05)。 ④G/A杂合sSNP与组织分化程度、局部淋巴结转移无关(P>0.05),而与原发部位(P=0.003)、T分期(P=0.002)及临床分期(P=0.001)有关。 ⑤G/A杂合sSNP主要存在于T1~2、临床分期Ⅰ~Ⅱ期及原发于喉咽的SCCHN中。 ⑥该sSNP与EGFR的表达无明显相关性(P>0.05)。 ⑦生存率分析表明G/A杂合患者与G/G纯合患者的生存期差异无统计学意义(P>0.05),目前的数据不能支持该sSNP为SCCNH独立的预后因素(P>0.05)。 【结论】 ①中国SCCHN患者中EGFR基因18~21号外显子发生突变的概率较低。 ②中国SCCHN患者中EGFR基因20号外显子第78号位点G/A杂合sSNP的发生率高于健康人群。 ③EGFR基因20号外显子第78位的sSNP可能成为一个有效的预测SCCHN,尤其是喉咽部鳞状细胞癌临床过程的指标。 ④EGFR基因20号外显子第78位的sSNP与EGFR的表达无关。 ⑤目前的数据并不支持EGFR基因20号外显子sSNP是中国SCCHN患者无病生存率的独立的预后因素。 第三部分头颈部鳞状细胞癌中EGFR基因表达调控的初步研究 【研究目的】 克隆人EGFR基因5′上游2875 bp的启动调控区片段,对该区域可能存在的功能性顺式作用元件进行初步分析。 【研究方法】 ①提取人基因组DNA,PCR扩增EGFR基因5′上游2875 bp(-2644~+231bp)启动调控区序列,插入pGL3-Basic,构建EGFR基因启动调控区-荧光素酶报道基因表达载体pGL3-EGFR-2875,酶切鉴定和测序分析证实插入片段是否正确。 ②pGL3-EGFR-2875瞬时转染喉癌细胞株Hep-2,荧光素酶报道基因分析检测启动子活性。 ③将C/EBPα等蛋白因子表达载体与pGL3-EGFR-2875共转染Hep-2细胞,报道基因分析观察C/EBPα等蛋白因子对启动子活性的影响。 ④应用RT-PCR和Western blot技术验证C/EBPα等蛋白因子的作用。 ⑤在pGL3-EGFR-2875基础上构建了3个较大范围的5′缺失突变体,与C/EBPα表达载体共转染Hep-2细胞,报道基因分析观察缺失突变对启动子活性的影响,并分析C/EBPα表达载体可能的作用区域。 【结果】 ①构建了较大范围的EGFR基因5′上游启动调控区重组质粒pGL3-EGFR-2875,酶切鉴定及DNA测序结果正确。 ②pGL3-EGFR-2875在Hep-2细胞呈现很强的启动子活性。 ③共转染实验结果显示C/EBPα的表达载体明显抑制EGFR启动子活性,RT-PCR和Western blot进一步证实C/EBPα对EGFR表达的抑制作用。 ④pGL3-EGFR-2875的缺失突变分析显示,C/EBPα表达载体的作用区域可能位于-618~+231 bp内。 ⑤-1619~-871 bp区域的缺失可导致启动子活性下降72%,说明该区域可能存在功能性正调控元件。 【结论】 ①正确克隆了人EGFR基因上游2875 bp(-2644~+231 bp)的启动调控区片段。 ②该2875 bp片段在喉癌Hep-2细胞中呈现了很强的启动子活性。 ③外源性C/EBPα过表达明显抑制EGFR启动子活性,并在mRNA和蛋白水平抑制EGFR表达,其抑制作用呈剂量依赖性。 ④C/EBPα的作用区域可能位于-618~+231 bp内。 ⑤EGFR基因启动调控区-1619~-871 bp区域可能存在功能性正调控元件。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R739.91

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