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新型反胶束介质中酶催化性能研究

张芸  
【摘要】: 利用酶进行物质的合成与转化,是生物学和化学领域交叉研究的热点之一,也是21世纪化学发展的趋势。其中,酶活力的保持和提高是生物合成与转化的关键。为了达到这一目的,除了可以通过酶的分子工程将酶进行修饰或改造之外,还可以对酶反应的微环境进行改变或修饰,后者及所谓的酶催化介质工程。 介质工程的研究经历了从水→有机溶剂→反胶束的过程。在水/有机溶剂两相体系和微水有机溶剂单相体系中,酶通常不能保持很好的催化性能。由于反胶束体系能够较好地模拟酶的天然环境,因而在反胶束体系中,大多数酶能够保持催化活性和稳定性。但是,目前的研究还存在着一些问题。首先,大多数研究都是基于商品化的离子型表面活性剂如二(2-乙基己基)琥珀酸磺酸钠(AOT)构成的反胶束来进行的,在这样的体系中,位于反胶束界面的表面活性剂的带电头基与水池中的酶之间往往存在强的静电作用力,从而导致酶活力的降低或丧失;其次,目前所有用于酶催化的反胶束体系都是用传统有机溶剂来形成的,这不仅会对酶活力构成影响,更对环境保护提出了严峻的挑战。因此,对构成反胶束的两大要素-表面活性剂和有机相进行改进是非常必要的。本论文分别从表面活性剂和溶剂两方面出发,论述了新型反胶束介质的构建,并且对酶在其中的催化性能进行了研究。 一.新型非离子表面活性剂反胶束的构建及其中的酶催化反应 目前用于酶催化研究的反胶束介质大多是用阴离子表面活性剂AOT来构成的。然而,在此体系中酶受界面电性质的影响活力往往不高。向AOT反胶束体系中添加非离子表面活性剂以提高酶活力的研究已有报道,但这样做只能在一定程度上减弱而不能消除界面电性质对酶活的影响。利用非离子型表面活性剂构建反胶束可以大大减弱酶与表面活性剂间的静电相互作用,然而现有的商品化的非离子表面活性剂大多需要添加极性醇等助表面活性剂且反胶束大小只能在小范围内可控。因此,很有必要尝试新型双尾基非离子表面活性剂。为此,我们合成了具有双尾基和糖头基的非离子型表面活性剂N-葡萄糖基谷氨酸二癸基酯(GGDE),并用来形成新型反胶束体系。 在由GGDE和TritonX-100(TX-100)构成的复配反胶束体系中,以木素过氧化物酶(LiP)催化氧化藜芦醇(VA)的反应为指示反应,研究了反胶束大小,缓冲溶液的pH以及H_2O_2浓度对LiP催化活力的影响。结果表明,在最佳反应条件下,LiP在GGDE/TX-100反胶束中的催化效率是其在AOT反胶束中的40多倍。在GGDE/TX-100反胶束中,非离子表面活性剂头基与LiP之间不存在强的静电作用力,LiP的活力得到充分发挥。 酵母醇脱氢酶(YADH)在GGDE/TX-100反胶束中的催化性能的研究再次证明了GGDE/TX-100反胶束作为酶催化反应介质的优越性。将YADH催化辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)氧化乙醇的反应作为指示反应,在各自的最佳反应条件下,YADH在GGDE/TX-100反胶束中的催化活力明显高于AOT反胶束中的活力。就动力学研究而言,YADH在GGDE/TX-100反胶束中催化反应的的转化数是AOT反胶束中的1.4倍,而底物乙醇和辅酶NAD~+在AOT反胶束中的米氏常数分别是GGDE/TX-100反胶束中的2倍和5倍。由此说明,胶束界面不仅会对YADH本身产生影响,对带有正电荷的辅酶NAD~+的影响更加显著。在AOT反胶束中,头基与NAD~+之间存在强的静电吸引力,导致辅酶与YADH结合减弱。从而,YADH在GGDE/TX-100反胶束中的催化效率要远大于在AOT反胶束中的催化效率。 二.离子液体对醇脱氢酶失活机制的探讨以及离子液体微乳液的应用 “绿色溶剂”室温离子液体(RTILs)作为酶催化反应介质引起了研究者们的兴趣。1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM][PF_6]是一种普通的疏水性离子液体。据报道,醇脱氢酶(ADH)在缓冲液和[BMIM][PF_6]两相体系中是具有催化活力的。但是,在[BMIM][PF_6]和亲水性离子液体(如1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐[EMIM][BF_4])的单相体系中,ADH是没有催化活力的。为了弄清离子液体对ADH的失活作用及其机理,本文定量研究了离子液体[BMIM][PF_6]对酵母醇脱氢酶(YADH)催化活力的影响以及相关的抑制机制,并且首次将离子液体微乳液引入酶催化反应。结果表明,在由H_2O,CH_3CH_2OH和[BMIM][PF_6]构成的均相溶液中,YADH活力随着[BMIM][PF_6]摩尔分数的增加而迅速下降。[BMIM][PF_6]对YADH的抑制作用可能是通过[BMIM][PF_6]中的咪唑基团与辅酶NAD~+竞争YADH的结合位点而引起的。同理可以解释季铵型离子液体对醇脱氢酶的失活作用。将酶促反应置于[BMIM][PF_6]微乳液中进行时,YADH显示出催化活性。在离子液体微乳液中,表面活性剂构成的界面膜将YADH与离子液体[BMIM][PF_6]隔离开来,从而避免了[BMIM][PF_6]对YADH的直接失活作用。在此微乳液中,YADH的催化活力能够达到51μM min~(-1)。这是在离子液体微乳液中进行酶催化反应的首次报道。 三.新型离子液体微乳液的研究 随着离子液体应用范围的不断扩展,对离子液体中的生物催化的研究活跃起来。实验表明,多种酶在离子液体或离子液体/水两相体系中体现出了较好的催化活力和立体选择性。但是,值得注意的是,研究证明只有悬浮在离子液体中的酶才具有催化活力,溶解在离子液体中的酶却是没有催化活力的,这就大大限制了酶的催化效率的发挥。H_2O/TX-100/[BMIM][PF_6]离子液体微乳液作为能够将酶单分子水平分散的均相溶液被用来尝试作酶催化反应介质取得了成功。我们的研究表明酵母醇脱氢酶、木素过氧化物酶以及漆酶在此体系中都能够保持催化活力。但这一离子液体微乳液相区大部分都在表面活性剂含量很高(>50%,W/W)的区域。这样以来会导致酶活力的损失以及反应后处理非常麻烦。所以,有必要开发表面活性剂含量较低的离子液体微乳液。AOT在有机溶剂中能够形成稳定的聚集体,并且具有良好的增溶水的能力,是传统反胶束中最常用的表面活性剂,于是我们尝试将AOT引入离子液体微乳液的构建。即在溶有适量非离子表面活性剂TX-100的离子液体中溶入少量的AOT,并加水使之形成微乳液。本文详细论述了H_2O/AOT-TX-100/[BMIM][PF_6]离子液体微乳液的构建和形成,并且对这种新型离子液体微乳液中的酶催化反应进行了初步的研究。以脂肪酶(lipase)催化的酯交换反应作为指示反应,研究了lipase在此微乳液体系中的催化性能。将lipase在几种离子液体微乳液中的催化活力作比较时发现,lipase在H_2O/AOT-TX-100/[BMIM][PF_6]微乳液中的催化活力与H_2O/TX-100/[BMIM][PF_6]中的催化活力相当,尽管与TX-100相比AOT是一个抑制作用较强的离子型表面活性剂。这说明利用此方法将离子液体微乳液中的表面活性剂含量降低是可行的。并且随着离子液体碳链的增加,lipase活力具有增加的趋势。这一研究结果不仅大大丰富了传统的胶束酶学理论,拓展了胶束酶学的适用范围,而且对今后的离子液体微乳液的深入研究具有指导意义。


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