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甾体化合物微生物转化的研究

林彦良  
【摘要】: 许多甾体化合物都具有很强的生理活性,临床上广泛应用于抗炎、抗毒、抗过敏、抗休克等。甾体药物的发现及成功合成是近半个世纪以来医药工业取得的最引人注目的两大进展之一,甾体药物也成为仅次于抗生素的第二大类药物。然而利用化学法合成时,往往合成步骤多,得率低,价格昂贵。1950年Murray和Peterson利用黑根霉高效转化黄体酮为11α-羟基黄体酮,使从孕酮合成皮质酮只需要3步,这一研究成果引起了微生物学者的极大兴趣,开展了大量的微生物对甾体转化的研究工作。 本文的主要研究内容及结果如下: 1.甾体化合物转化菌株的筛选 从山东省济南市郊区及黄河附近的稻田、豆地、玉米地以及菜地采集土样,经富集培养,涂布于以植物甾醇和胆固醇为唯一碳源的平板上,分别筛选得到10株和48株菌株,将菌株接种于发酵培养基中培养72 h,对转化产物进行薄层色谱(Thin Layer Chromatography,TLC)分析,结果发现一株真菌X4和一株细菌B4分别能够将植物甾醇和胆固醇转化成几种产物。通过形态观察和18S rDNA序列分析对真菌X4进行鉴定,结果显示X4为串珠镰刀菌(Fusarium moniliformeSheld);利用菌株形态观察、BIOLOG技术和16S rDNA序列分析对细菌B4进行鉴定,结果显示B4为博德特氏菌(Bordetella sp.B4),博德特氏菌转化胆固醇尚属首次报道。 2.Fusarium moniliforme Sheld转化玉米粉和黄豆粉中的植物甾醇为AD的研究 Fusarium moniliforme Sheld能够转化植物甾醇为几种产物,利用TLC和HPLC对产物进行分析,结果显示其中一种产物的Rf(TLC)和Rt(HPLC)与标准品雄甾-4烯-3,17-二酮(Androst-4-ene-3,17-dione,AD)均一致。通过制备型TLC和HPLC对该产物进行分离纯化,利用紫外光谱(Ultraviolet spectrum,UV),红外光谱(Infrared spectrum,IR),质谱(Mass Spectrum,MS)和核磁共振(NuclearMagnetic Resonance,NMR)对该产物进行结构鉴定,结果表明该产物为AD。AD是甾体激素类药物不可替代的中间体,因此具有重要的应用价值。然而,植物甾醇在水中的溶解度非常低,导致转化率很低,寻找一种更好的植物甾醇转化体系是非常必要的。考虑到玉米粉和黄豆粉中含有丰富的植物甾醇,天然状态下的植物甾醇在水中的分散度更好,于是对Fusarium moniliforme Sheld直接转化玉米粉和黄豆粉中的植物甾醇为AD进行了研究,结果表明Fusarium moniloformeSheld能高效转化玉米粉中的植物甾醇,AD最高产率能够达到83.5%,并且省去了植物甾醇的提取过程,节省了成本;同时,利用硫磷铁显色法对玉米粉和黄豆粉中的植物甾醇进行定量,并与传统的HPLC定量方法进行比较,结果显示两种方法的定量结果吻合得比较好,而硫磷铁显色法更为快捷方便。 3.Bordetella sp.B4转化AD的研究 利用筛选得到的Bordetella sp.B4转化AD,对其转化产物进行TLC分析,结果显示Bordetella sp.B4能够将AD转化为三种主要产物,通过IR、MS、UV及NMR等技术对产物进行结构分析,三种产物分别被鉴定为雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD),9α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD),3-hydroxy-9,10-secoandrost-1,3,5-triene-9,17-dione(3-OH-SATD),Bordetella sp.B4转化AD此前未见报道。 对β-环糊精包合AD的条件进行了初步摸索,发现β-环糊精与AD以质量比2:1混合研磨,高温灭菌后,包合效果最好,使AD的溶解度明显增加,有利于Bordetella sp.B4转化AD的快速进行。 利用HPLC法检测转化过程中各产物浓度随时间变化情况,发现在30℃和37℃条件下,9α-OH-AD浓度在16 h就能够达到最高值,分别为0.502g/L和0.765 g/L,然而没有ADD产生;40℃和45℃的条件下都有少量的ADD产生,最高浓度分别能达到0.123g/L和0.196g/L,考虑到9α-羟化酶催化AD生成9α-OH-AD,而1,2位脱氢酶催化AD形成ADD,推测1,2位脱氢酶的最适作用温度应该高于9α-羟化酶。Bordetella sp.B4对AD的转化效率优于大多数已报道菌株,且温度对Bordetella sp.B4转化AD的影响也与已报道菌株不同。 4.Bordetella sp.B4转化胆固醇的研究 利用Bordetella sp.B4转化胆固醇,对其转化产物进行TLC分析,结果显示Bordetella sp.B4能够将胆固醇转化成一种产物,通过MS、UV及NMR等方法对产物进行分析,结果证明这个产物为胆甾酮。通过对Bordetella sp.B4发酵液中胆固醇氧化酶活性检测,发现Bordetella sp.B4能够产胞外胆固醇氧化酶。 利用正交试验对Bordetella sp.B4产酶培养基进行优化。结果显示,酵母粉对产酶的影响是最大的,随着浓度的增加,酶活迅速增加,当浓度达到20 g/L时酶活最高,为最适浓度;胆固醇浓度在3 g/L时,酶活最高,随着胆固醇浓度的增加,酶活逐渐下降,其原因可能是胆固醇浓度过高会造成底物抑制,浓度过低导致诱导作用减弱;葡萄糖浓度为7.5 g/L时,酶活最高,随着浓度提高,酶活逐渐降低,其原因可能是葡萄糖浓度过高影响菌体对胆固醇的利用;微量离子液添加体积为200 mL/L时,酶活最高。经过两轮正交试验获得最优组合为胆固醇3.0 g/L,葡萄糖7.5 g/L,酵母粉20 g/L,微量离子液200 mL/L。将Bordetella sp.B4接种于最优培养基中,胆固醇氧化酶的酶活能够达到650 U/L,较优化前提高了5倍左右。进一步对其他培养条件优化,发现优化培养基的初始pH为7.0,接种量为4%,转速为260 rpm时,酶活能够达到1700 U/L,较优化前提高了13倍。 5.Bordetella sp.B4产胆固醇氧化酶的分离纯化及酶学性质研究 利用分级硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose离子交换色谱、Sephadex G100凝胶过滤层析对Bordetella sp.B4产胆固醇氧化酶进行分离纯化,获得电泳纯胆固醇氧化酶,SDS-PAGE显示该酶分子量约为55 kDa;胆固醇氧化酶以胆固醇为底物最适作用温度为37℃,在50℃以下都比较稳定,最适作用pH为7.0,在pH4-10的范围都比较稳定;在pH 7.0的磷酸缓冲体系中,以胆固醇为底物测定时,该酶的米氏常数K_m为5.56×10~(-4) mol/L;除了Hg~(2+)和Ag~+对该酶有抑制作用外,大部分金属离子对其酶活都有促进作用,Cu~(2+)的影响最为明显,能够将酶活提高2.19倍;辛醇/水分配系数(log P_(ow))较小的甲醇、乙醇和丙酮对该酶都有抑制作用,而log P_(ow)为-1.38的二甲基亚砜的影响却很小,该酶在log P_(ow)较大的乙酸乙酯、丁醇、氯仿、苯、二甲苯及环己胺的作用下都比较稳定,显示了很好的应用前景。 6.Bordetella sp.B4产多糖的初步分析 利用分级硫酸铵沉淀对胆固醇氧化酶进行初步分离时,有大量的多糖与胆固醇氧化酶共同析出,说明Bordetella sp.B4在产胆固醇氧化酶的同时还分泌一种多糖。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)能够与该多糖结合成络合物使其从发酵液中沉淀出来,将络合物解离、乙醇沉淀、干燥获得多糖粗品。利用咔唑法检测多糖粗品中葡萄糖醛酸含量,发现多糖粗品中约含40%的葡萄糖醛酸。通过DEAE-cellulose离子交换色谱对多糖进行进一步分离纯化,获得多糖精品。利用IR对多糖精品进行初步分析,结果显示此多糖具有-OH、C=O、C-N、N-H和-COOH的特征吸收峰,将此多糖的IR光谱图与透明质酸的相比较,发现二者非常相似,推测此多糖可能为透明质酸。


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