高三尖杉酯碱诱导的白血病耐药细胞基因表达谱的变化

【摘要】： 白血病(Leukemia)是临床常见的血液系统恶性肿瘤,化疗仍是其治疗的主要手段。高三尖杉酯碱(Homoharringtonine,HHT)系从粗榧属植物中提取的一种生物碱,是高效抗白血病药物,主要用于急性髓细胞白血病、慢性粒细胞白血病和骨髓增生异常综合征的治疗。近期研究表明,HHT还可用于干扰素治疗失败和伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病的治疗。然而,临床治疗中发现,长时间应用HHT治疗后患者会出现多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象,它与蒽环类、鬼臼类及长春新碱类等还有交叉耐药性。白血病细胞产生MDR是导致白血病复发及化疗失败的主要原因,现今研究初步证实其多药耐药机制涉及P-gp等跨膜糖蛋白、GSH/GST等酶系统、DNA修复以及多种凋亡相关基因等,但仍不能圆满解释白血病细胞产生MDR的机制,而且在临床上根据现有的多药耐药机制采取的逆转耐药措施并不十分有效。因此,寻找新的与HHT耐药相关基因,揭示耐药机制,进而发展新的逆转耐药方法十分必要。主要研究内容和主要结果如下: 第一部分:基因芯片筛选K562/HHT细胞多药耐药相关基因 基因芯片技术是一种快速高通量地分析细胞或生物体中核酸序列信息的研究方法。将该技术运用于肿瘤耐药研究有助于筛选新的耐药相关基因,对于肿瘤耐药机制研究及耐药个体化诊断具有重要促进作用。为此,本部分研究运用基因芯片技术来研究HHT诱导的白血病多药耐药细胞株K562/HHT基因表达谱的变化,初步筛选出与K562/HHT细胞多药耐药相关的基因。 目的用基因芯片技术筛选出与K562/HHT细胞多药耐药相关的基因。 方法在前期建立的K562/HHT多药耐药细胞株的基础上,采用基因芯片技术两两比较K562/HHT细胞与其亲本细胞K562,K562/HHT细胞与用耐药逆转剂米非司酮(RU486)作用后的细胞K562/HHT/RU486间的基因表达谱差异。 结果K562/HHT与K562细胞相比,共有117个基因表达有显著差异,其中57个基因表达明显上调,60个基因表达明显下调,K562/HHT中多药耐药基因mdr-1表达明显上调(Ratio=4.2899);K562/HHT/RU486细胞与K562/HHT细胞相比,有13个基因表达明显上调,37个基因表达明显下调。这些差异表达的基因涉及耐药、细胞信号传导、细胞分化、细胞增殖、转录调节基因以及离子转运等。基因NM-001721(BMX)、NM-031459(SESN2)、NM-033642(FGF13)和AL-049309(SFRS12)在两组芯片中的表达均有显著差异。其中BMX基因(bone marrow tyrosine kinase gene inchromosome X)在K562/HHT细胞中表达较K562细胞上调(Ratio=2.6036),在K562/HHT/RU486细胞则较K562/HHT细胞减低(Ratio=0.4603)。 结论运用基因芯片技术获得了与HHT诱导的多药耐药细胞K562/HHT耐药相关候选基因的信息。 第二部分:BMX参与HHT诱导的白血病多药耐药细胞株K562/HHT耐药及机制的初步研究 BMX是从人骨髓细胞中克隆、分离到的一种基因,定位于染色体Xp22.2,其mRNA长度2.7kb,编码一种80kD的蛋白,属于细胞内非受体型酪氨酸蛋白激酶Tec/Btk家族。BMX广泛表达在动脉内皮、胎儿心内膜、粒细胞、骨髓细胞株以及前列腺细胞株等,参与胞内外多种信号转导,其功能非常广泛,与细胞粘附、迁移、增殖和存活等相关。然而目前还没有关于BMX与白血病细胞耐药性的相关研究。在前部分研究中我们用基因芯片技术筛选与K562/HHT细胞耐药相关的候选基因,发现BMX可能与HHT诱导的白血病多药耐药细胞K562/HHT的耐药性形成相关,该部分进一步验证BMX基因在HHT诱导的白血病细胞耐药形成中的作用,并探讨其作用机制。 目的探讨BMX基因在HHT诱导的人白血病耐药细胞K562/HHT耐药性形成中的作用及其机制。 方法运用RT-PCR和Western blot法验证分别从mRNA和蛋白水平验证BMX在K562和K562/HHT细胞中表达的基因芯片结果后,将BMX质粒分别转染到K562和K562/HHT细胞,然后运用MTT法和流式细胞术观察这两种细胞对几种常用化疗药物的耐药性的变化和细胞内柔红霉素(DNR)含量的变化。 结果RT-PCR和Western blot法均证实BMX在K562/HHT细胞中表达较K562细胞上调,K562/HHT/RU486细胞中BMX表达较K562/HHT减低。BMX质粒转染成功后,MTT法发现转染BMX质粒的K562细胞获得耐药性,而转染BMX质粒的K562/HHT细胞耐药性增加。流式细胞术检测到转染BMX质粒后的K562及K562/HHT细胞内DNR含量分别为(79.28±4.04)和(29.84±2.67),均较转染前(158.52±8.08)和(58.58±6.53)显著减低。 结论发现BMX与高三尖杉酯碱诱导的多药耐药细胞K562/HHT多药耐药性的形成相关,BMX可通过减少细胞内药物积累来介导耐药。