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《山东大学》 2009年
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宁动颗粒及天麻素治疗抽动—秽语综合征的分子机制研究

吕红  
【摘要】: 背景 抽动-秽语综合征(Tourette's syndrome,TS)是一种无意识的、无目的的、重复的刻板活动为特征的神经精神性疾病。临床表现为头面、腹部及四肢不自主的抽动,喉部发出奇特叫声或罢骂不避亲疏为特征。TS有不规则的发作间歇期,有时可因转移注意力而减轻,睡眠时症状消失,精神紧张时症状加重。该病常伴随注意缺陷、多动冲动或强迫症状。TS诊断标准为:1.具有多种运动性抽动及一种或多种发声性抽动,有时不一定在同一时间出现。2.抽动每天发作多次,通常为一阵阵发作,病情持续或间断发作已超过一年,其无抽动间歇期连续不超过三个月。3.上述症状引起明显的不安,显著地影响社交、就业和其他重要领域的活动。4.发病于18岁前。5.上述症状不是直接由某些药物(如兴奋剂)或内科疾病(如亨廷顿舞蹈病或病毒感染后脑炎)引起。尽管TS是一种轻症的神经精神疾病,但病程长,反复发作,影响正常的生活和学习。近于一半的病人抽动症状会持续到18岁以后,甚者部分病人抽动症状可以持续一生,大约有5%的TS病人有影响生存的症状,称之为恶性TS。多巴胺(dopamin,DA)系统的过度活跃和受体超敏感均有可能引起抽动的发生。因此抑制DA系统功能是治疗TS的重要途径。 TS的发病与社会心理因素、遗传因素、中枢神经递质的代谢异常等因素有关。而DA系统功能异常被广泛认为是导致TS发病的主要病理学基础。应用DA受体激动剂在动物身上能产生突发、反复的定型肌肉运动等一系列的酷似TS的症状和体征。DA神经元主要集中在中脑和基底节,其中黑质、纹状体DA的密度约占脑内DA的80%。位于黑质致密层的DA神经元接受纹状体的投射纤维,终止于纹状体背侧神经元;源于脚间核上中线的DA神经元终止于中脑边缘系统通路。黑质-纹状体通路是调节一切行为反应的基本结构,中脑-中脑边缘的DA通道平衡失调致边缘系统抑制障碍被认为是TS的神经生化基础。脑内DA的前体物质来源于食物中的酪氨酸,在限速酶酪氨酸羟化酶的作用下生成多巴,后者又在多巴脱羧酶的作用下生成DA。DA在脑内主要在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下降解为高香草酸(homovanillic acid,HVA),排出体外。HVA是中枢神经系统中DA的主要代谢产物,通常被作为DA活性的主要指标。研究证明TS患者壳核DA释放量明显高于对照组,血清及脑脊液中HVA较正常对照组明显降低,且降低程度与症状严重程度明显相关。被释放的DA分别与纹状体内神经元上的多巴胺D1受体(DopamineReceptor D1,DRD1)和多巴胺D2受体(Dopamine Receptor D2,DRD2)结合,最终使大脑皮质运动区兴奋或去抑制,而产生抽动现象。有研究证明TS患者DA能神经系统异常,尤其是DA能神经系统过度活跃或突触后DA受体超敏感,导致慢性反复出现不自主的动作及发音上的抽动。DRD2被认为与TS关系更为密切,TS患者纹状体内DRD2数目、密度较同年龄、同性别对照明显升高。综上研究表明,TS患者纹状体内DA含量升高,其血清中代谢产物HVA含量减少,纹状体内DRD2活性增强。 氟哌啶醇(Haloperidol,Hal)作为DRD2阻滞剂至今仍为治疗TS的有效药物。但氟哌啶醇的副作用相对比较大,其副作用的发生直接与剂量相关。常见的副作用有嗜睡、镇静、乏力、头昏、椎体外系反应(如肌张力障碍、静坐不能、帕金森氏病样震颤等),服用数月后,可能出现类帕金森氏病的症状,如震颤、肌肉僵直等,长期应用氟哌啶醇可导致迟发性运动障碍的发生,表现为不自主的刻板运动,并具有持续性。有如此诸多副作用,一定程度上限制了该药物的临床应用。 宁动颗粒(Ningdong granule,NDG)是临床治疗TS的中药复方制剂,已应用于临床多年,并显示出良好的效果。有研究证明天麻素(Gastrodin,Gas)能抑制动物DA系统活性,有显著的镇静、抗癫痫及神经保护作用。本课题采用阿朴吗啡(Apomorphine,Apo)诱导TS大鼠模型,观察宁动颗粒及天麻素对TS大鼠刻板活动的影响;检测TS大鼠血清内HVA、纹状体内DA含量及DRD2基因及蛋白表达的强弱,初步探讨宁动颗粒及天麻素对TS大鼠DA系统的影响,并阐明宁动颗粒及天麻素治疗TS的作用机制,为宁动颗粒及天麻素治疗TS提供科学理论依据。 目的 1.观察宁动颗粒及天麻素对TS模型大鼠刻板活动的影响。 2.观察宁动颗粒对TS模型大鼠纹状体内DA含量、DRD2 mRNA表达和蛋白表达,以及血清中HVA含量的影响。探讨宁动颗粒治疗TS的作用机制。 3.观察天麻素对TS模型大鼠血清中HVA含量及纹状体内DRD2 mRNA表达的影响。探讨天麻素抑制TS的机制。 方法 1.研究对象:4周龄雄性Wistar大鼠96只,随机分为6组,每组16只:(1)空白对照组;(2)阿朴吗啡组(Apo);(3)氟哌啶醇组(Hal);(4)宁动颗粒加氟哌啶醇组(NG+Hal);(5)宁动颗粒低剂量组(NGL);(6)宁动颗粒高剂量组(NGH);(7)天麻素组(Gas)。空白对照组腹腔注射生理盐水5 ml/(kg·d),其余6组腹腔注射Apo 2.0 mg/(kg·d)。连续注射4周。Hal组给予氟哌啶醇1.0mg/(kg·d)(相当于临床用量的10倍);NG+Hal组给予氟哌啶醇1.0mg/(kg·d)+宁动颗粒250mg/(kg·d)(相当于临床用量的10倍);NGL组给予宁动颗粒250mg/(kg·d)(相当于临床用量的10倍);NGH组给予宁动颗粒370mg/(kg·d)(相当于临床用量的15倍);Gas组给予天麻素20.0mg/(kg·d);空白对照组及Apo组分别给予等量蒸馏水。各组大鼠均灌胃给药,每日10:00 am给药1次,连续给药12周。末次给药后禁食24 h,不禁水。3%戊巴比妥钠(30mg/kg,腹腔注射)麻醉,心脏取血分离血清,-20℃保存备用。多聚甲醛全身灌注,留纹状体固定备用,另取新鲜脑组织,-80℃保存备用。然后进行后续实验。 2.研究内容:(1)大鼠行为评分测定大鼠用药后行为;(2)酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中HVA含量;(3)ELISA法检测纹状体内DA含量;(4)免疫组织化学染色法检测纹状体内DRD2蛋白表达;(5)RT-PCR法检测纹状体内DRD2 mRNA表达。 结果 1.大鼠行为研究 与空白对照组比较,Apo可以显著引起大鼠刻板活动。根据大鼠行为测定曲线图所示,连续注射Apo 4周后大鼠出现持续稳定的刻板活动(P<0.01)。给药后Hal组、NG+Hal组和NGH组大鼠刻板活动与Apo组比较明显减弱(P均<0.01),且三组间相比差异无统计学意义(P>0.05)。Gas组大鼠刻板活动与Apo组比较明显减弱(P<0.05),且与Hal组相比差异无统计学意义(P>0.05)。NGL组刻板活动虽有所减弱,但与Apo组相比差异无统计学意义(P>0.05),与Hal组、NG+Hal组和NGH组相比有显著性差异(P<0.05)。 2.血清中HVA含量比较 与空白对照组比较,Apo组大鼠血清HVA含量明显降低(4.76±0.95 mg/mlvs 3.49±0.66 mg/ml,P<0.01)。各治疗组大鼠血清HVA含量均有所升高,与Apo组相比差异具有显著性(P<0.01),其中NG±Hal组升高最为显著(4.94±0.86 mg/ml vs 3.49±0.66 mg/ml,P<0.01)。其次为NGH组(4.86±1.48mg/ml vs 3.49±0.66 mg/ml,P<0.01)。Hal组(4.81±1.60 mg/ml vs 3.49±0.66 mg/ml,P<0.01)。NGL组(4.77±1.15 mg/ml vs 3.4±0.66 mg/ml,P<0.01),4治疗组之间相比差异无统计学意义(P>0.05)。Gas组(4.69±1.30 mg/ml vs 3.49±0.66mg/ml,P<0.05),与Hal组之间相比差异无统计学意义(P>0.05)。 3.纹状体中DA含量比较 与空白对照组比较,Apo组大鼠纹状体内DA含量明显升高(103.42±44.39ng/ml vs 240.23±72.32 ng/ml,P<0.01)。给药后Hal组、NG+Hal组、NGL组和NGH组大鼠纹状体内DA含量均有所降低。NGH组纹状体内DA含量降低最显著,与Apo组相比差异具有显著性(136.04±50.95 ng/ml vs 240.23±72.32ng/ml,P<0.01)但Hal组、NG+Hal组和NGL组DA含量与Apo组相比无显著性差异(208.20±104.01 ng/ml vs 240.23±72.32 ng/ml,P>0.05;202.36±102.22ng/ml vs 240.23±72.32 ng/ml,P>0.05;214.40±81.07 ng/ml vs 240.23±72.32 ng/ml,P>0.05),三组间相比差异无统计学意义(P>0.05),与NGH组比较有显著性差异(P<0.01)。 4.大鼠脑组织切片纹状体DRD2光镜下DAB染色,灰度比较 与空白对照组比较,Apo组大鼠纹状体内DRD2灰度明显升高(P<0.01)。给药后Hal组、NG+Hal组、NGL组和NGH组大鼠纹状体内DRD2灰度均有所降低。NGH组下降最为显著(P<0.01),其次为Hal组和NG+Hal组,两组与Apo比较均有显著性差异(P<0.05),NGL组与Apo组相比差异无统计学意义(P>0.05)。NGL组和NGH组相比差异具有显著性(P<0.01)。 5.大鼠纹状体内DRD2 mRNA表达比较 与空白对照组比较,Apo组大鼠纹状体内DRD2 mRNA表达明显升高(P<0.01)。给药后Hal组、NG+Hal组、NGL组和NGH组大鼠纹状体内DRD2mRNA表达均有所降低。NG+Hal组下降最为显著(P<0.01),其次为Hal组和NGH组,两组与Apo比较均有显著性差异(P<0.05),Hal组、NG+Hal组和NGH组与NGL组相比差异具有显著性(P<0.05)。NGL组与Apo组相比差异无统计学意义(P>0.05)。Gas对大鼠纹状体内DRD2 mRNA表达的影响无统计学意义(P>0.05). 结论 宁动颗粒及天麻素对TS模型大鼠具有明显抑制刻板活动的作用,能抑制DA系统兴奋性,促进DA代谢,增加血清中HVA含量;同时表明宁动颗粒还具有显著降低纹状体内DA含量、抑制纹状体内DRD2蛋白及mRNA表达的作用。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R277.7

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