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新型蛋白酶体抑制剂地钱素M诱导前列腺癌PC3细胞凋亡的研究

许爱辉  
【摘要】: 前列腺癌(prostate cancer, PCa)作为常见的男性恶性肿瘤,在我国的发病率较欧美国家低,但近年来呈明显的增长趋势,且中晚期患者的比例远远大于国外,由于PCa潜伏期长,发病机制复杂,尚无有效的治疗手段,因此,PCa的预防与治疗一直备受关注。目前激素撤除治疗是中晚期前列腺癌的首选方法,通过手术、抗雄激素类药物的激素阻断治疗,对约80%的前列腺癌有效。然而绝大多数肿瘤经治疗后,PCa发展为激素难治性前列腺癌(hormone refractory prostate cancer, HRPC),对抗内分泌治疗,预后差,死亡率高。PCa由激素治疗敏感到耐受的演变是复杂的多因素、多信号途径参与的过程。 尽管对HRPC的病理机制有相当深入的研究,至今临床无有效的治疗方案,化疗依然是主要的治疗手段。针对雄激素受体途径、抗凋亡基因、血管生成因子、生长因子受体、信号通路蛋白等靶点的各种化学药物、疫苗、单克隆抗体等均能有效抑制前列腺癌细胞增殖,诱导其凋亡,显示出良好的效果。如多西紫杉醇常用于晚期HRPC的治疗,通过稳定微管、诱导凋亡而发挥作用,是唯一被证实可明显延长HRPC患者生存期的药物,使HRPC的化疗取得了新的进展,同时也显示出天然产物作为抗肿瘤药物的巨大潜力。因此,研究HRPC的发病机制、探索新的治疗靶点及方法,是预防与治疗HRPC的有效策略。 泛素-蛋白酶体(ubiquitin-proteasome system, UPS)是哺乳动物细胞内主要的蛋白水解酶体系,能够精确降解细胞内各种靶蛋白,对于细胞周期运转、细胞分化与凋亡、免疫应答、信号转导等生理过程起着重要的调控作用。对恶性肿瘤细胞而言,蛋白代谢紊乱,UPS调节失衡,使UPS与肿瘤的发生发展、多药耐药、免疫监控逃逸等病理过程密切相关。而抑制UPS对肿瘤细胞比正常细胞更为敏感,可导致细胞周期阻滞、细胞凋亡等。因此UPS成为肿瘤治疗的新靶点,蛋白酶体抑制剂(proteasome inhibitors)也成为一种非常有前景的抗肿瘤药物。因此,发现新的蛋白酶体抑制剂为抗肿瘤药物的研究提供了新思路,而天然产物以其独特的结构类型更是受到研究者的青睐。 苔藓植物作为从水生到陆生过渡的一类高等植物,品种繁多,抗虫害、抗腐烂等独特的生物特性导致其化学成分结构多样,包括萜类化合物、酚类化合物和联苄类化合物等,是发现药效活性分子的宝贵资源。双联苄类化合物作为苔藓植物的成分之一,是新型植物抗生素,具有广泛的生理活性,具有抗菌、抗病毒、细胞毒等活性。我们通过对50多种联苄类化合物进行抗肿瘤活性筛选,发现其中一些化合物具有很好的抑制肿瘤细胞增殖活性。双联苄化合物地钱素M(Marchantin M, Mar)具有抑制肿瘤细胞增殖活性,且对前列腺肿瘤细胞的抑瘤活性显著。本文就双联苄化合物地钱素M抑制激素非依赖性前列腺癌PC3细胞增殖的机制进行了初步探索。 首先通过细胞增殖实验检测地钱素M的抑瘤活性,结果显示地钱素M对人肝癌HepG2细胞的抑制作用较弱,对人白血病K562细胞和腺体瘤包括人乳腺癌MCF-7细胞、前列腺癌LNCaP、DU145和PC3细胞抑制作用比较明显,特别是对激素非依赖性前列腺癌PC3细胞的增殖抑制作用尤为显著,而地钱素M对正常人视网膜上皮细胞hTERT-RPE1细胞毒性作用较小,表明肿瘤细胞对地钱素M更为敏感。 BrdU掺入实验表明,地钱素M以浓度依赖的方式显著抑制PC3细胞的增殖活性。流式细胞术分析结果显示,地钱素M阻滞PC3细胞于G0/G1期。分析G0/G1期周期相关蛋白的表达,结果显示,地钱素M诱导周期蛋白激酶抑制蛋白p21~(cip1)的表达,抑制CyclinDl的表达,同时使Rb蛋白的磷酸化程度降低,抑制细胞周期G1/S期的转变。另外,流式细胞术分析结果出现显著的亚二倍体峰,提示地钱素M抑制细胞增殖可能与诱导细胞凋亡有关。进一步研究发现,经地钱素M处理后的PC3细胞的形态发生显著变化,Giemsa染色和PI/Hoechest33342双染结果显示,细胞变圆,脱落明显,且细胞形态出现凋亡细胞的特征性改变,DAPI染色观察到细胞核发生明显的凋亡性变化。Westernblotting结果显示,地钱素M处理后,PC3细胞内的抗凋亡蛋白Bcl2的表达下调,而促凋亡蛋白Bax的表达明显增高,其Bax/Bcl2的比率显著增加。由于Caspase在细胞凋亡中发挥重要作用,我们的检测结果表明,地钱素M能够激活PC3细胞中Caspase 3活性,促进多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的剪切,说明地钱素M可能以Caspase依赖的方式诱导PC3细胞凋亡。而经地钱素M处理后,细胞内Caspase 9和Caspase 4的活性增加,但Caspase 8活性并无明显改变,表明线粒体、内质网途径可能参与地钱素M诱导PC3细胞凋亡的作用,但其机制仍需进一步研究。由于地钱素M与茶多酚的结构相似,后者已被证实具有抑制蛋白酶体的作用,因而我们检测地钱素M对蛋白酶体的酶解活性的影响。检测结果显示,地钱素M在体外显著抑制纯化的20S蛋白酶体的糜蛋白酶样活性、多肽/谷氨酰水解酶活性,其抑制作用随浓度的增加而增强。而经地钱素M作用后PC3细胞内糜蛋白酶样活性、多肽/谷氨酰水解酶活性随着地钱素M作用浓度的增加、作用时间的延长而显著降低,表明地钱素M具有明显的抑制蛋白酶体活性的作用。因此,地钱素M可能是通过抑制蛋白酶体活性发挥了诱导PC3细胞凋亡的作用。 总之,本研究结果表明,双联苄类化合物地钱素M具有抑制激素非依赖性前列腺癌PC3细胞增殖、引起细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡的作用。其作用机制可能是通过抑制蛋白酶体活性诱导细胞凋亡,线粒体和内质网可能参与其诱导凋亡的过程。本研究首次报道一种新型的蛋白酶体抑制剂,为天然的双联苄化合物的进一步开发利用提供了新的思路。


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