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《山东大学》 2010年
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非诺贝特和瘦素对高血压肾脏和腹主动脉损伤的保护作用及机制的研究

侯晓阳  
【摘要】: 背景 在过去10年中,随着人口老龄化及生活水平的提高,高血压患者日益增多,高血压性肾损害发病率也在明显上升。目前,高血压是仅次于糖尿病的第二大致终末期肾病(end-stage renal disease, ESRD)的病因,占所有ESRD的百分之三十。相关统计资料表明,每13个高血压患者就有1例发展成ESRD,在接受降压治疗的高血压患者中,4%-16%的患者蛋白尿排泄异常。虽然近年来高血压的治疗取得了很大的进展,但是高血压所导致的肾损害的发生率却呈逐年上升的趋势,提示临床上应用抗高血压药物治疗的肾保护作用还远远不够。因此,如何降低高血压肾损伤的发病率是目前基础研究和临床实践的重要课题。 高血压肾脏损伤主要表现为蛋白尿、良性肾小球硬化、间质纤维化以及炎症细胞浸润。除了神经内分泌激素,如去甲肾上腺素、血管紧张素Ⅱ以及醛固酮等,氧化应激也是高血压肾病发生和进展的重要因素。氧化应激不但可以通过脂质过氧化等直接损伤肾脏组织,还能作为第二信使激活细胞内信号转导系统,表达相应的活性产物,诱导炎症细胞浸润,引起炎症反应间接损伤肾脏组织。在氧化应激诱导产生的各种活性产物中,TGF-β1起关键性作用。TGF-β1不但可以调节细胞外基质的合成和降解,还可以诱导小管上皮细胞发生上皮-间充质转分化,最终引起细胞外基质的过度沉积。而细胞外基质的过度沉积是高血压肾病的主要特征。 PPARs是1990年发现的核激素受体超家族的新成员,有三种亚型:PPARα、PPARβ/δ和PPARγ。其中PPARα于肾脏、肝脏和心脏中高表达,并在调节糖脂代谢中起重要作用。PPARα激动剂在临床上是常用的降甘油三酯药物。近年来发现PPARα激动剂还有抗氧化的作用,并且能抑制高血压心肌重构,但是PPARα激动剂对高血压肾损伤是否有保护作用及其机制还未有报道。 针对以上问题,我们提出如下假说:PPARα激动剂非诺贝特能够抑制高血压肾损伤的进展;其机制可能是通过抑制氧化应激和MAPK活性从而抑制下游TGF-β1、TIMP-1的表达、间质成纤维细胞的活化以及炎症细胞浸润所引起的炎症反应。 目的 1、观察26周龄SHR肾脏结构和功能的损伤程度; 2、观察PPARα激动剂非诺贝特是否对SHR肾脏损伤具有保护作用; 3、探讨PPARα激动剂非诺贝特对SHR肾脏保护作用的可能机制。 方法 1.实验动物和分组:八周龄雄性SHR大鼠24只,随机分为阳性对照组即SHR组(n=10)和非诺贝特组(n=14);同周龄WKY大鼠10只作为正常对照组即WKY组(n=10)。非诺贝特组给予非诺贝特(力平之)60mg·kg-1·d-1灌胃18周,WKY组和SHR组以等量生理盐水灌胃。 2.体重和血压:实验过程中,每两周测量体重1次,每两周检测尾动脉血压1次。 3.尿蛋白和肾功能的检测:实验末留取24小时尿检测24小时尿蛋白排泄率;实验末抽取右心室静脉血检测血清肌酐和尿素氮含量。 4.病理形态染色:应用PAS染色观察皮质肾小球硬化;应用Masson染色观察皮质肾小管间质纤维化。光学显微镜采集图像,并用Image ProPlus 5.0作定量分析。 5.免疫组化染色:应用免疫组化染色观察间质成纤维细胞的活化和单核/巨噬细胞在肾脏皮质中的浸润。将处理好的组织切片用含有α-SMA和ED1一抗的1%BSA进行孵育,并用辣根过氧化物酶标记的二抗进行处理。使用DAB显色,光学显微镜采集图像。 6.MDA检测:肾皮质组织匀浆的制备,应用考马斯亮兰蛋白法测定肾皮质组织匀浆蛋白浓度;采用硫代巴比妥酸法检测肾皮质组织MDA的含量。 7.SOD活性检测:肾皮质组织匀浆的制备,应用考马斯亮兰蛋白法测定肾皮质组织匀浆蛋白浓度;采用黄嘌呤氧化酶法检测肾皮质组织T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的活性。 8.蛋白印迹分析:使用组织裂解液提取肾皮质组织总蛋白。将含有30μg蛋白的每个标本和蛋白Marker一起分别加入不同的泳道。在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳,再用一湿电转染仪电转染到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上。将膜封闭后,使用一抗孵育,清洗后,再使用HRP结合的二抗孵育。滴加显色液显色。强弱用表达的蛋白和β-actin条带积分光密度的比值表示。 9.实时定量PCR:使用Trizol提取肾皮质组织总RNA。应用逆转录酶将mRNA逆转录成cDNA。使用Applied Biosystems TaqMan 7900HT detection系统进行实时PCR。采用MCP-1、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD与β-actin的循环阈值(threshold cycle, Ct)的比值并通过公式:起始模板浓度=2-ΔΔCT。注:ΔΔCT=(干预组目的基因CT值-β-actin CT值)-(对照组目的基因CT值-β-actin CT值),表示mRNA的相对水平。 结果 1. PPARα激动剂非诺贝特降低SHR 24小时尿蛋白排泄率:相比于WKY大鼠,26周龄SHR表现为低体重、蛋白尿和血压升高,而肾功能晚期指标肌酐和尿素氮正常;非诺贝特显著降低SHR 24小时尿蛋白,但是对血压和体重没有明显作用。 2. PPARα激动剂非诺贝特抑制SHR皮质肾小球硬化和间质纤维化:PAS染色结果表明WKY大鼠没有肾小球硬化,而SHR有少量肾小球出现节段性硬化;Masson染色结果表明SHR肾小管间质明显纤维化;免疫组化结果表明SHR肾小球和肾小管间质中α-SMA表达明显增加,说明间质中成纤维细胞活化,合成和分泌细胞外基质的功能增强。非诺贝特显著抑制SHR皮质肾小球硬化、肾小管间质纤维化以及间质中成纤维细胞的活化。 3. PPARα激动剂非诺贝特抑制SHR肾皮质细胞外基质重构:免疫印迹结果表明,相比于WKY大鼠,SHR肾皮质胶原Ⅳ. MMP-9和TIMP-1表达均升高,非诺贝特显著抑制它们在高血压大鼠肾皮质中的表达。 4. PPARα激动剂非诺贝特抑制SHR肾脏间质炎症细胞的浸润:实时定量PCR结果表明,与WKY组大鼠比较,SHR组大鼠肾皮质MCP-1的mRNA表达上调;非诺贝特明显抑制SHR肾皮质MCP-1 mRNA的表达;免疫组化结果表明,相比于WKY大鼠,SHR皮质肾小球和肾小管间质中单核/巨噬细胞明显增多,非诺贝特显著抑制单核巨噬细胞的浸润。说明非诺贝特能够抑制SHR肾皮质内的炎症反应。 5. PPARα激动剂非诺贝特抑制SHR肾皮质组织氧化应激损伤:相比于WKY大鼠,SHR肾皮质组织MDA水平明显升高;非诺贝特显著降低SHR肾皮质组织MDA水平,说明非诺贝特能够抑制SHR肾皮质氧化应激损伤。 6. PPARα激动剂非诺贝特抑制SHR肾皮质NADPH氧化酶亚单位P47phox的表达并增加Cu/Zn-SOD活性和表达:相比于WKY大鼠,SHR肾皮质组织P47phox的蛋白表达明显增加,而Cu/Zn-SOD活性及mRNA水平明显降低,Mn-SOD活性及mRNA水平没有明显改变,提示SHR肾皮质不但有氧化系统激活,而且抗氧化系统减弱,最终导致肾皮质氧化应激损伤;非诺贝特显著抑制P47phox的蛋白表达,并增加Cu/Zn-SOD活性及mRNA的表达,从而减轻肾皮质氧化应激损伤。 7. PPARα激动剂非诺贝特抑制SHR肾皮质组织TGF-β1表达和MAPK活性:免疫印迹结果表明,相比于WKY大鼠,SHR肾皮质组织TGF-β1表达增加,磷酸化的JNK和p38MAPK明显增加,而总JNK和p38MAPK没有明显变化;非诺贝特显著抑制SHR肾皮质组织TGF-β1的表达及JNK和p38MAPK的磷酸化。 结论 1.26周龄SHR肾脏损伤表现为蛋白尿、轻度皮质肾小球硬化、肾小管间质纤维化和炎症细胞浸润,基本符合人类高血压早期肾损伤的病理改变。 2. PPARα激动剂非诺贝特显著降低SHR尿蛋白排泄率,减轻皮质肾小球硬化、肾小管间质纤维化和炎症细胞浸润,对高血压肾脏具有保护作用。 3. PPARα激动剂非诺贝特对SHR的肾保护作用可能是通过抑制氧化应激和MAPK活性从而抑制下游TGF-β1、TIMP-1的表达以及炎症细胞浸润所引起的炎症反应。 4. PPARα激动剂非诺贝特的抗氧化作用对氧化应激性肾脏损伤具有潜在的治疗作用。 背景 腹主动脉瘤(andominal aortic aneurysm, AAA)是局部血管壁膨胀,超过正常血管直径的50%的一种病理状态。AAA的病理学改变主要表现为炎症细胞的侵入,动脉中层弹力蛋白基质结构的破坏和平滑肌细胞减少。在美国60岁以上人群的年发病率约为3%,每年大约46,000人需要手术治疗,导致15,000人死亡。国内的发病率也呈逐年上升的趋势。目前临床上尚没有被证明有效的AAA治疗药物.治疗选择仅限于腔内或有创手术治疗。由于这种高危疾病给人们带来的危害随着生活人类生活水平的提高和人口老龄化而不断增加,关于AAA发病机制和找到可阻断或延缓这一过程的有效药物成为近年来研究的热点。 近年来对AAA的病因及病理生理学已有了崭新的认识,传统的动脉粥样硬化学说并不符合AAA的发病特点,多因素致病,复杂的退行性病变包括慢性炎症浸润、细胞外基质的重塑成为共识。其中多种蛋白水解酶家族对血管壁细胞外基质的降解是多种原因诱发AAA的最终途径,其中基质金属蛋白酶家族是具有最关键作用的蛋白降解酶家族。来自不同团队的多个研究表明人类AAA是一种慢性炎症性疾病,表现为Th2型细胞因子(IL-4)占主导低位,而Th1型细胞因子(尤其是INF-γ)减少。因此,如何抑制Th2型细胞因子在AAA中的表达将是治疗AAA的新的策略。 瘦素(Leptin)是由肥胖(obese, ob)基因编码、脂肪细胞分泌的一种非糖基化的多肽激素,通过与中枢及外周组织的受体结合,在能量代谢、神经内分泌系统、生殖系统、心血管系统以及骨骼形成等方面发挥重要的调节作用,具有重要的生理病理意义。近年来的研究表明,瘦素作为一种细胞因子样激素在免疫系统中所发挥的作用越来越受到关注。瘦素可以促进T细胞的增殖、活化和细胞因子合成,促使Th细胞向Th1方向分化,并抑制Th2型细胞因子的释放。目前已有研究证实瘦素可以通过调节Th1/Th2促进动脉粥样硬化斑块的形成,但是瘦素对动脉瘤的作用目前还未见报道。 针对以上问题,我们提出如下假说:瘦素能够抑制AAA的形成和进展,其作用机制可能是通过诱导Th1型细胞因子,同时抑制Th2型细胞因子来起作用。 目的 1.构建AngⅡ诱导ApoE-/-小鼠高血压AAA模型; 2.观察Leptin是否对AngⅡ诱导的ApoE-/-小鼠高血压AAA具有保护作用; 3.探讨Leptin对AngⅡ诱导ApoE-/-小鼠高血压AAA保护作用的可能机制。 方法 1. AngⅡ诱导的ApoE-/-小鼠高血压AAA模型的构建及Leptin的干预:八周龄雄性ApoE-/-小鼠皮下埋装有AngⅡ或Saline的渗透泵。根据体重调节AngⅡ的浓度,使AngⅡ的泵速维持在1000ng/kg·min,持续输注28天;同时每天腹膜下注射Leptin (0.6μg/g BW)或Saline,输注28天。 2.体重和血压:实验过程中,每周测量体重1次,每周检测尾动脉血压1次。 3.血清脂质的检测:实验末抽取右心室静脉血检测血清甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、游离脂肪酸的浓度。 4.AAA的测量:通过Image ProPlus 5.0软件测量右肾动脉至最后一个肋间动脉之间,肾上腹主动脉的最大宽度。将腹主动脉最大宽度超过正常小鼠肾上动脉宽度的50%定义为动脉瘤。 5.病理形态染色:应用Verhoeff弹力纤维染色观察AAA的病理改变,光学显微镜采集图像。 6.免疫组化染色:应用免疫组化染色观察Th1 (INF-γ)/Th2 (IL-4)型细胞因子的表达及定位。将处理好的组织使用含有INF-γ或IL-4一抗的1%BSA进行孵育,并用辣根过氧化物酶标记的二抗进行处理。使用DAB显色,光学显微镜采集图像。 7.蛋白印迹分析:使用组织裂解液提取小鼠腹主动脉组织总蛋白。将含有30μg蛋白的每个标本和蛋白Marker一起分别加入不同的泳道。在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳,再用一湿电转染仪电转染到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上。将膜封闭后,使用一抗孵育,清洗后,再使用HRP结合的二抗孵育。滴加显色液显色。强弱用表达的蛋白和β-actin条带积分光密度的比值表示。 结果 1. Leptin对AngⅡ持续输注诱导的高血压没有明显作用:相比于ApoE-/-组小鼠,ApoE-/-+AngⅡ组小鼠血压明显升高;腹腔注射Leptin对ApoE-/-+AngⅡ小鼠血压没有明显作用。 2. Leptin对血清脂质没有明显影响:相比于ApoE-/-组小鼠,ApoE-/-+AngⅡ组小鼠血清胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇的含量明显升高,而游离脂肪酸、甘油三酯无明显变化;Leptin对ApoE-/-小鼠血清脂质无明显影响。 3. Leptin降低ApoE-/-+AngⅡ小鼠AAA的发生率并减轻其严重程度:持续输注AngⅡ诱发巨大AAA形成;腹膜腔注射Leptin可以降低输注AngⅡ诱发的AAA的发生率和严重程度。 4. Leptin降低ApoE-/-+AngⅡ小鼠AAA组织中MMP-2和MMP-9蛋白的表达:相比于ApoE-/-组小鼠,ApoE-/-+AngⅡ组小鼠AAA组织中MMP-2和MMP-9蛋白的表达明显升高;腹膜腔注射Leptin可以显著降低ApoE-/-+AngⅡ小鼠AAA组织中MMP-2和MMP-9蛋白的表达。 5. Leptin降低ApoE-/-+AngⅡ小鼠AAA组织中Th2型细胞因子IL-4蛋白的表达:Western blot结果证实ApoE-/-+AngⅡ小鼠AAA组织中IL-4的表达较对照组明显增加;腹膜腔注射Leptin可以显著降低IL-4的表达。免疫组织化学结果与Western blot结果一致。 6. Leptin增加ApoE-/-+AngⅡ小鼠AAA组织中Thl型细胞因子IFN-γ蛋白的表达:Western blot结果证实ApoE-/-+AngⅡ小鼠AAA组织中IFN-γ的表达较对照组无明显增加;腹膜腔注射Leptin可以显著增加IFN-γ的表达。免疫组织化学结果与Western blot结果一致。 结论 1.AngⅡ持续输注能够诱发ApoE-/-小鼠高血压AAA的形成。 2. Leptin降低AngⅡ诱导的ApoE-/-小鼠高血压AAA的发生率及严重程度,对血压和血脂无明显作用。 3. Leptin对高血压AAA的保护作用可能是通过调节Th1/Th2型细胞因子的表达:Leptin促进Thl型细胞因子的表达,抑制Th2型细胞因子的表达,从而抑制其诱导的MMP-2和MMP-9的表达对血管壁的弹性蛋白和胶原蛋白的降解。 4. Leptin的免疫调节作用可能对高血压AAA具有潜在的治疗作用;该结果也支持动脉粥样硬化和动脉瘤是两种不同的血管疾病,具有不同的致病机制的观点。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R544.1

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