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《山东大学》 2010年
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撤除生长因子对hUCMSCs增殖和细胞外基质表达的影响

蔡直锋  
【摘要】: 目的: 人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)具有多向分化潜能和自我更新能力,其诱导植入有望成为应用广泛的细胞治疗手段。为了快速获得足够数量的hUCMSCs,研究人员常在培养基中添加生长因子以促进细胞生长。但是当hUCMSCs输入人体后,没有添加的生长因子的继续作用,细胞的增殖、迁移及定植能力是否会受到影响呢?细胞外基质与细胞的增殖、迁移及定植能力密切相关,因此本实验研究了细胞外基质的表达情况。 本研究的目的是:1.研究完全撤除表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)对细胞增殖及细胞外基质表达的影响。2.保留半量的EGF、bFGF、VEGF是否可以维持细胞增殖及细胞外基质的表达。 方法: 1. hUCMSCs的分离培养及表型鉴定脐带在采集后6 h内用植块法分离培养,每3-4d换液1次,达到80%融合时以细胞密度5×104个/cm2传代培养,取第5代稳定生长的hUCMSCs用流式细胞仪进行表型鉴定。 2.实验分组取第5代hUCMSCs,细胞生长达70%融合时为细胞换液撤除因子,并将细胞分为三组:对照组,生长因子浓度同前;实验组1,将生长因子浓度突然减半;实验组2,所换培养基不添加任何生长因子,仅含正常浓度的血清。 3.瑞氏-姬姆萨法染色观察细胞形态:将第5代hUCMSCs接种至24孔板,细胞生长达70%融合时按分组为细胞换液,继续培养30小时后行瑞氏-姬姆萨法染色观察细胞形态。 4.MTT法细胞计数:按分组将第5代hUCMSCs种植于96孔板,每孔加入5×103个细胞(200μL),在37℃、5%C02条件下孵育30小时后进行MTT法计数。 5.实时定量PCR (real-time Q-PCR)检测细胞凋亡相关基因及胞外基质基因的表达。 5.1 Trizol法提取总RNA将细胞接种至6孔板,细胞生长达70%融合时为细胞换液,分上述3组,继续培养15小时后吸出培养液,每孔加入Trizol 1 ml,提取总RNA。 5.2紫外分光光度法测所提取总RNA浓度,按说明书进行反转录制备cDNA。 5.3实时定量PCR检测胶原蛋白-Ⅰ(Collagen-Ⅰ, Col-Ⅰ),胶原蛋白-Ⅳ(Collagen-Ⅳ, Col-Ⅳ),纤连蛋白(Fibronectin, FN),层粘连蛋白(Laminin, LN),整合素(Integrin),粘胶蛋白(Tenascin-C),基质金属蛋白酶-2(MatrixMetalloprotease-2, MMP-2),基质金属蛋白酶-7(Matrix Metalloprotease-7,MMP-7),基质金属蛋白酶-9 (Matrix Metalloprotease-9, MMP-9), BCL-2,BAX基因的表达情况。 结果: 1.细胞表形检测结果 所获得的贴壁细胞CD34和CD45阴性表达,CD44、CD105、CD71、CD90阳性表达,符合间充质干细胞的特征。 2. hUCMSCs的形态学观察 2.1对照组:细胞扁平或长梭形,可见突起,胞核较大,扁卵圆形,染色质细小稀疏着色浅,核仁明显,胞质较丰富,呈弱嗜碱性,可见嗜碱性颗粒。 2.2实验组1:细胞扁平或长梭形,部分细胞较对照组变大、变圆,核质比减小。 2.3实验组2:多数细胞较对照组变大、变圆,核质比减小 3.MTT法细胞计数结果 与对照组相比,实验组2细胞数目减少,但不具显著差异(P=0.16);实验组1细胞数目略有增加,亦不具显著差异(P=0.49)。 4.实时定量PCR结果 4.1凋亡相关基因BCL-2和BAX表达情况撤除生长因子后BCL-2表达上调,BAX表达下调,BCL-2/BAX比率增大,实验组1较实验组2 BCL-2表达上调、BAX表达下调幅度更大,BCL-2/BAX比率更高。 4.2胞外基质基因表达情况与对照组相比,半量撤除因子时,Col-Ⅰ、FN、LN、Integrin和Tenascin-C表达增高,完全撤除时Col-Ⅰ、FN表达增高,LN、Integrin和Tenascin-C表达下调。而Col-Ⅳ、MMP-2、MMP-7和MMP-9半量撤除和完全撤除时均减少,完全撤除时减少更多。 结论: 1.撤除EGF、VEGF、bFGF会降低hUCMSCs的增殖能力,保留半量生长因子可以维持hUCMSCs的增殖能力。 2.撤除因子可导致细胞体积变大,核质比减小。 3.撤除因子后,BCL-2/BAX比率增大,细胞的抗凋亡能力增强,半量撤除时细胞的抗凋亡能力较完全撤除时更强。 4.撤除生长因子会影响细胞外基质的表达,而保留半量生长因子可以改善这种情况。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R329

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