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《山东大学》 2010年
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血管内皮生长因子调控胃癌及胆管癌侵袭转移作用的实验研究

赵锐  
【摘要】: 研究背景和意义 恶性肿瘤的侵袭和转移是一个多步骤、多阶段的复杂过程。癌变的细胞和组织会发生一系列的变化,包括细胞转化、肿瘤生长、血管及淋巴管的诱导生成及癌细胞扩散到循环系统;然后在靶器官中粘附、侵袭和增殖。目前已经有数种细胞因子被证实参与肿瘤的转移;其中,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)不仅参与肿瘤血管的生成,还参与伤口愈合及其他重要的病理过程。VEGF通过两种机制诱导肿瘤血管的生成,一是主要通过其同源性受体VEGFR2,二是通过非VEGFR途径,其中包括整合素的上调和(或)激活。 整合素是一种异二聚体跨膜蛋白,通过VEGF及其受体的协调,能够诱导细胞粘附于细胞外基质(extracellular matrix,ECM)。整合素αvβ6在正常的上皮细胞几乎不表达,而在生长中的胚胎组织及许多上皮性恶性肿瘤中高表达。前期研究中,我们已经证实了整合素αvβ6可用来作为胃癌预后的指标之一。另外αvβ6在结肠癌中的表达可促进基质金属蛋白-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)分泌的增加。在胃癌组织中,MMP-9可降解细胞外基质,从而促进肿瘤细胞的播散和转移。由此可见,αvβ6通过MMP-9降解ECM屏障和介导肿瘤细胞的侵袭性。 有研究证实整合素与VEGF在细胞的粘附、侵袭和转移过程中具有协同作用。整合素α1β1和α2β1可促进VEGF介导的信号转导和内皮细胞的侵袭作用。VEGF与整合素共同参与多发性骨髓瘤细胞的侵袭。在结肠癌细胞中,α9β1阻断抗体可以特异性的抑制VEGF-A诱导的血管生成。然而,整合素αvβ6在VEGF介导的肿瘤细胞侵袭转移过程中的作用尚未明确。 VEGF-C是VEGF家族的新成员,是一种酪氨酸激酶受体,其主要表达在内皮组织的淋巴系统内。在一些恶性肿瘤,如:乳腺癌、胃癌以及肺癌中呈高表达,并且有研究证实VEGF-C的表达与肿瘤的侵袭以及淋巴转移密切相关。但是很少研究VEGF-C在胆管癌中的表达以及与胆管癌侵袭转移之间的关系。 本次研究的目的是研究整合素αvβ6的表达和VEGF的关系,以及它们在体外对胃癌细胞侵袭性的影响;并且研究VEGF-C在胆管癌侵袭转移过程中所起的作用。 第一部分VEGF及整合素αvβ6在胃癌中的表达 目的研究VEGF以及整合素αvβ6在胃癌组织及细胞中的表达情况 方法收集手术切除的胃癌组织标本,冰冻储存于-80℃低温冰箱中。应用免疫组化的方法检测VEGF以及整合素αvβ6在胃癌组织的表达情况。体外培养胃癌AGS细胞,采用流式细胞技术、免疫荧光以及免疫沉淀检测胃癌细胞中整合素的表达情况。 结果30例胃癌标本的免疫组织化学分析显示,其中26例VEGF染色阳性,13例整合素αvβ6染色阳性。其中VEGF以及整合素αvβ6均表达阳性的有10例标本。流式细胞仪检测胃癌AGS细胞中整合素αvβ6呈现高表达,而且阳性率大于90%;细胞免疫荧光结果显示AGS细胞膜中整合素的表达,而应用免疫沉淀技术检查蛋白水平整合素αvβ6的表达情况。 结论VEGF以及整合素αvβ6在胃癌组织中均有表达;整合素αvβ6在胃癌细胞系AGS细胞中呈现高表达。 第二部分VEGF介导的胃癌细胞侵袭作用与整合素αvβ6相关 目的探讨整合素αvβ6在VEGF促进胃癌细胞侵袭、转移能力的作用,寻求控制胃癌转移的靶点。 方法体外培养AGS细胞,外源性VEGF(30ng/ml)刺激24h,应用流式细胞仪、Real-time PCR、Western blot以及免疫沉淀检测整合素αvβ6、P-ERK和MMP-9在mRNA以及蛋白水平的表达变化。 再应用体外培养的AGS细胞,分别用ERK通路阻断剂U0126以及鼠抗人整合素αvβ6单克隆抗体10D5预处理后,外源性VEGF(30ng/ml)刺激24h,收集细胞并检测整合素αvβ6、P-ERK和MMP-9在mRNA以及蛋白水平的表达变化。 针对人整合素基因序列设计其特异性siRNA序列。用荧光标记的阴性对照siRNA筛选转染条件,按照预实验筛选的转染条件将β6 siRNA转染到无血清培养液处理过的AGS细胞中,48h后收集细胞进行抑制效应分析,荧光定量PCR检测β6 mRNA的表达,以无血清培养基及对照siRNA为对照。AGS细胞转染β6 siRNA成功后,采用外源性VEGF刺激,收集细胞检测整合素β6、P-ERK和MMP-9在mRNA以及蛋白水平的表达。趋化小室试验检测外源性VEGF介导的AGS细胞侵袭能力。β6 siRNA转染的AGS细胞,以及分别用ERK通路阻断剂U0126以及鼠抗人整合素αvβ6单克隆抗体10D5预处理的AGS细胞,加入包被好的小室上层,在有无外源性VEGF介导的情况下,观察转移到小室下层的细胞个数,从而反应其不同条件下的侵袭能力。 结果应用免疫沉淀、流式细胞仪以及细胞免疫荧光,可以发现体外培养的AGS细胞内有整合素αvβ6的表达,其主要表达在细胞膜,而且表达的阳性率在90%以上。AGS细胞在外源性VEGF(30ng/ml)刺激24h后,整合素αvβ6、P-ERK和MMP-9在mRNA以及蛋白水平的表达明显增加,与对照组相比具有统计学意义。而应用ERK通路阻断剂U0126以及鼠抗人整合素αvβ6单克隆抗体10D5预处理后,外源性VEGF(30ng/ml)刺激24h,整合素αvβ6、P-ERK和MMP-9在mRNA以及蛋白水平的表达显著被抑制,与对照组相比具有统计学意义。荧光显微镜观察见筛选后的转染条件下荧光标记siRNA的转染效率较高,超过90%。在β6 siRNA转染的无血清培养液处理过的AGS细胞中,在有无外源性VEGF作用的条件下,整合素αvβ6、P-ERK和MMP-9在mRNA以及蛋白水平的表达得到相同的结论。趋化小室实验检测到在外源性VEGF介导的情况下,转移至小室下层的AGS细胞数明显增加。而应用ERK通路阻断剂U0126、鼠抗人整合素αvβ6单克隆抗体10D5以及β6 siRNA转染预处理后,转移至小室下层的AGS细胞数显著减少,与对照组相比具有统计学意义。 结论胃癌AGS细胞内有整合素αvβ6的表达;外源性VEGF (30ng/ml)作用于AGS细胞后,可以刺激整合素αvβ6、P-ERK和MMP-9在mRNA以及蛋白水平的表达显著增加以及提高AGS细胞的侵袭能力,而且这种作用可以被ERK通路阻断剂U0126、鼠抗人整合素αvβ6单克隆抗体10D5以及β6 siRNA转染预处理显著抑制,与对照组相比具有统计学意义。这说明整合素αvβ6参与了VEGF介导的胃癌侵袭转移作用,并且ERK通路在此过程中起着一定的作用。 第三部分VEGF-C在胆管癌中的表达及侵袭转移中的作用研究 目的研究VEGF-C在胆管癌癌组织中的表达情况及促进胆管癌癌细胞侵袭、转移能力的作用。 方法收集手术切除的胆管癌组织标本,冰冻储存于-80℃低温冰箱中。应用免疫组化的方法检测VEGF-C在胆管癌组织的表达情况,回顾性分析这些病人的临床病例资料,并与免疫组化结果相结合,分析VEGF-C的表达与患者临床资料之间的关系;体外培养胆管癌FRH-0201细胞,并且在有无外源性VEGF-C作用的情况下,采用增殖实验以及趋化小室实验检测胆管癌细胞FRH-0201的侵袭转移能力。 结果VEGF-C在胆管癌组织中呈高表达,表达率约为75.4%;其表达与病人的年龄、性别以及肿瘤大小、肿瘤的临床分期无明显关系,而与肿瘤的淋巴结转移明显相关。胆管癌细胞在外源性VEGF-C的作用的情况下,胆管癌细胞的增殖以及侵袭能力明显被增强,与对照组相比具有统计学意义。 结论VEGF-C在胆管癌组织中呈高表达并且在其侵袭转移过程中起着一定的作用。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R735

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