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微包埋培养技术的建立及其在粘细菌分离纯化中的应用

高秀珍  
【摘要】: 社会性的粘细菌在生长过程中呈现出聚团生长和细胞密度依赖性等社会性行为。具体表现为,当细胞的接种密度低于105 cells/ml时,细胞不能在新的环境中生长起来,而细胞一旦生长起来,大量的细胞聚集在一起形成一个个紧密的菌团。粘细菌这种协同成长的特性严重限制了粘细菌的分离纯化工作,如纤维堆囊菌埃博霉素生物合成改造后期突变株的分离纯化。 在本文的工作中,我们以SA-CaCl2体系为基础进行包埋条件的优化,建立了以1.2%SA为凝胶介质,2%SrCl2为交联剂的包埋体系。通过此体系,我们制备得到了为直径为1.2±0.5 mm的凝胶球粒,其中约80%的凝胶球粒直径为1mm以内;每毫升SA凝胶可制备1500-2500个球粒。将分散至单细胞状态的纤维堆囊菌细胞包埋在海藻酸锶凝胶球粒中。通过控制单细胞悬液的浓度及凝胶球粒的直径及数目,实现了对单个纤维堆囊菌细胞的包埋。通过与高浓度、未包埋的纤维堆囊菌细胞共同培养,最终实现了凝胶球粒内单个细胞的生长。含有细胞的凝胶球粒在高浓度磷酸盐的平板上溶胀后,通过将其转接到正常的培养基上,实现了对内部细胞的扩大培养,从而获得了纯化的单克隆。应用此方法,我们将预先混合的、同源性为99%的两株纤维堆囊菌进行分离。随机挑选的18个凝胶球粒内的细胞经16S rRNA测序证实,球粒内部生长起来的细胞为同种细胞。由此,我们实现了对纤维堆囊菌混合培养物的分离纯化。此技术一方面利用海藻酸盐凝胶介质的交联结构将细胞限定在一定的空间内,阻断了纤维堆囊菌细胞生长过程中的粘连聚集;另一方面,通过将包埋有单细胞的凝胶球粒与未包埋的高浓度细胞共同培养,利用凝胶介质形成的交联网孔允许细胞生长所需要的生长起始因子自由通过的能力,帮助凝胶球粒内极低密度的细胞克服细胞密度依赖性而顺利生长增殖。 在建立的微包埋培养技术的基础上,我们以纤维堆囊菌野生菌株作为助长菌株,对实验室前期得到的埃博霉素生物合成改造突变株进行包埋纯化。随机挑选4株经包埋培养得到的突变株进行epothilone产量检测,得到了具备突变株遗传特性的、埃博霉素产量存在显著差异的单克隆。该技术克服了纤维堆囊菌突变株传统分离纯化过程中纯化效率低下且耗时较长的弊端,将大大加快纤维堆囊菌次级代谢途径改造的工作进程,提高工作效率。 粘细菌的分离纯化通常是利用粘细菌能够形成子实体的能力进行的。该方法有许多的局限性,例如,单个粘细菌细胞不容易形成菌落;子实体结构不稳定,在许多情况下,子实体会退化甚至是丢失;粘细菌的低生长率使得粘细菌很容易受到其它快速生长的细菌和真菌的污染。考虑到这些局限性,我们将建立的微包埋培养技术应用于开发土壤中溶细菌型粘细菌资源。通过采用不同的粘细菌种属作为助长菌株,我们对同一土样进行了四批包埋培养。我们以粘细菌孢囊杆菌亚目特异性探针为筛选手段,以凝胶球粒内生长的粘细菌的16S rRNA基因部分序列(448bp)为基础绘制系统进化树。通过进化树分析,我们从土壤中分离得到了大量溶细菌型粘细菌,这部分粘细菌独立于课题组之前从该土样中分离得到的粘细菌。对这部分粘细菌进行人工后续培养得到了15株粘细菌,对其进行分类鉴定后再次证实我们得到了新的粘细菌菌株。微包埋技术在开发土壤中尚未培养的粘细菌资源工作上可能具有重要的应用潜质。由于目前人工培养方法的限制,我们仅得到了部分菌株的可培养形式。


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