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《山东大学》 2010年
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提高甘氨酸甜菜碱含量的转基因小麦的抗逆性分析

张伟伟  
【摘要】: 干热风和干旱是限制小麦产量的最重要的非生物逆境因子。干热风是低湿、高温和风力共胁迫的灾害气候,而水资源短缺更是公认的全球性环境问题之一。长期以来,国内外对如何提高小麦的抗干热风和抗旱能力开展了广泛而深入的研究。随着植物基因工程的发展以及大量抗逆基因的鉴定和克隆,利用基因工程方法培育抗逆作物新品种已成为减轻逆境胁迫的重要手段。 小麦分布广、种植面积大,需求量与供应量之间的矛盾却随着自然环境恶化和人口增长愈来愈突出。基因工程技术的发展和应用,为培育抗逆小麦品种及增加小麦产量开辟了新途径。但由于小麦基因组大、离体培养受基因型的影响大等原因,利用基因工程技术改良小麦的抗逆性研究远落后于其它主要农作物。因此,小麦抗逆基因工程研究具有重要意义。 本论文以本实验室已得到的转甘氨酸甜菜碱合成途径的酶基因(来自大肠杆菌的编码胆碱脱氢酶基因betA、来自嗜盐藻青菌的甘氨酸肌氨酸甲基转移酶基因ApGSMT2和二甲基甘氨酸甲基转移酶基因ApDMT2)的小麦为材料,开展转基因小麦抗干热风和抗旱性研究。 一、转betA基因小麦的干热风抗性分析 选取来自济南17的转betA基因纯合株系BL1、BL2、BL3及其未转基因对照株系,于灌浆期模拟干热风胁迫处理3天,然后恢复自然条件。胁迫处理后,转基因株系植株整体长势较好,旗叶青枯失水较少,与野生型相比甜菜碱含量明显较高。 生理测定结果显示:干热风胁迫下各株系叶绿素含量都降低,但转基因株系的叶绿素含量始终高于野生型的。干热风胁迫抑制了所有植株的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率:然而转基因植株的受抑制程度明显低于野生型的。在测定过程中,旗叶温度不断升高,但转基因株系的旗叶温度明显低于未转基因对照株系的,这有利于维持较高的灌浆速率。与未转基因植株相比,转基因株系的最大光化学效率(Fv/Fm)在处理后仍然维持在一个较高的水平。干热风胁迫处理3天后,转基因株系旗叶的蔗糖磷酸合成酶(SPS)与蔗糖合成酶(SS)的活性明显高于野生型对照。这些结果表明转基因株系在干热风胁迫处理中能合成较多的碳水化合物,能更好地维持灌浆速率。这与旗叶中可溶性总糖和蔗糖含量的测定结果一致。 与未处理组相比,干热风处理3天后各株系株高没有明显变化,穗长和穗粒数略有降低。胁迫处理后植株发生青枯、旗叶持绿面积减小,但转基因植株的旗叶持绿面积要显著大于未转基因的。干热风处理组的百粒重、株粒重均大幅下降,其中株系BL2、BL3与野生型相比差异达到显著性或极显著性水平,即转betA基因植株表现出显著提高的抗干热风特性。 二、转ApGSMT2和ApDMT2基因小麦的抗旱性分析 将除草剂筛选和PCR检测为阳性的转ApGSMT2和ApDMT2基因的T2代种子和野生型(济麦19)的种子分别播到蛭石盘中,待小苗长到3—4叶期时进行除草剂抗性(选择标记基因为epsp,编码的酶抗除草剂草甘膦)筛选,统计转基因株系中除草剂抗性植株的比例,根据卡方(X2)检验推定外源基因在转基因植株中的遗传行为是否符合孟德尔分离规律。在得到的21个T2代转基因株系中,外源基因均稳定存在。对除草剂筛选后的植株进行PCR和RT-PCR检测。大部分除草剂抗性植株的PCR结果为阳性,RT-PCR检测结果表明目的基因ApGSMT2和ApDMT2在不同株系中的表达强度有差异,表达量最高的株系为AL6。 苗期是小麦对缺水较敏感的时期,此阶段受到干旱胁迫会使小麦的分蘖能力下降,从而影响产量。选取目的基因表达量高的3个T2代转基因株系AL1、AL4、AL6和野生型(济麦19)进行苗期持续干旱处理,观测植株生长状态并测定目的基因表达量和甘氨酸甜菜碱含量、相对含水量、光合速率等生理指标,确定转基因株系是否具有较高的抗旱性。 测定结果表明,转基因植株在干旱处理中长势较好,分蘖数多;严重干旱胁迫时发生永久性萎蔫较晚,复水后存活率高且能够较快恢复生长。在适度干旱处理中,转基因株系的目的基因表达丰度随着胁迫时间的延长而升高,甘氨酸甜菜碱积累水平也大幅度提高,两者呈显著的正相关,即目的基因表达强度高的株系甘氨酸甜菜碱含量也较高。 5叶期小麦幼苗持续干旱7天后,野生型植株失水严重,叶片萎蔫;而转基因植株叶片萎蔫程度低,相对含水量较高。并且,转基因株系的叶片细胞离子渗漏率和MDA含量均显著低于野生型的,即转基因株系的细胞膜损伤和膜脂过氧化程度较轻。细胞中较多可溶性物质的积累有利于细胞吸水和维持正常的膨压。干旱胁迫使得所有株系叶片的细胞可溶性糖和游离氨基酸含量升高,而转基因植株可溶性糖和脯氨酸的积累量显著高于野生型的。干旱胁迫条件下,转基因株系的叶绿素含量、净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均高于野生型的,其中株系AL6与野生型相比达到差异显著水平。光化学系统Ⅱ(PSⅡ)的活性测定表明转基因株系小苗PSⅡ复合体受伤害程度较轻。这些结果表明,转ApGSMT2和ApDMT2基因小麦具有比野生型对照明显提高的耐旱性。 由于ApGSMT2和ApDMT2催化以甘氨酸为底物合成甘氨酸甜菜碱的代谢反应,分析干旱处理前后植株的氨基酸含量变化有助于评估基因的应用价值。干旱处理后,干旱处理后,丝氨酸含量在所有株系中均有升高,但野生型植株中升高幅度大,转基因株系升高幅度小,且含量明显低于野生型的;野生型植株中甘氨酸含量升高,转基因株系均有下降且含量与野生型相比差异极显著。这表明在转基因株系中有大量的甘氨酸用于甘氨酸甜菜碱合成,由丝氨酸合成甘氨酸的速率也相应提高。甘氨酸是植物体内能够合成且大量存在的一种氨基酸,相对于以胆碱为底物合成甘氨酸甜菜碱的途径,这条途径受底物浓度制约较小,这种优势无疑会促进利用该代谢途径的基因工程发展。 综上所述,在已有工作基础上,本工作选出了抗干热风和抗旱能力显著提高的转基因小麦株系,这为培育抗逆小麦新品种创造了优异材料;同时为深入了解小麦抵御非生物胁迫的分子机制提供了有价值资料。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S512.1

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