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《山东大学》 2010年
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粘球菌及其细胞群体行为环境适应的分子机制研究

潘宏伟  
【摘要】: 粘细菌以群体运动、子实体发育及捕食等复杂的多细胞群体行为而著称。自然环境中,粘细菌通过群体的运动和捕食行为来利用难降解底物或微生物细胞;当营养贫瘠时,细胞通过群体运动聚集形成子实体结构和抗逆性的粘孢子来抵抗不利的环境(Shimkets,1990)。与其复杂的多细胞群体行为相对应,粘细菌具有较其他细菌更为庞大的基因组和复杂的调控系统(Zusman et al,2007; Goldmanet al.,2006)。由于粘细菌的多细胞群体行为依赖固体介质表面,目前分离得到的粘细菌菌株绝大多数来自于各种土壤环境(Reichenbach,1999; Dawid,2000)少量水环境中分离发现的嗜盐或耐盐粘细菌来自近海。在系统发生和生活模式上,嗜盐粘细菌属于海洋生境的本地类群,而耐盐粘细菌的形成则是土壤粘细菌向海洋环境适应进化的结果(Zhang et al,2005)。Myxococcus fulvus HW-1 (ATCC BAA-855)是一株能够耐受海水盐浓度生长的菌株。在低浓度海水培养条件下,HW-1具有与土壤粘球菌类似的生活模式;但是当海水浓度增加到一定程度时,HW-1又具有完全不同于陆生粘球菌的生活模式:在营养贫瘠的固体培养条件下营养细胞可以直接转化形成具有抗逆性的粘孢子(Zhang et al,2005)。耐盐粘细菌以其随海水浓度而迁变的细胞行为特性成为我们对海洋粘细菌环境适应研究的有益模式菌株。 作为单细胞生物,细菌通常被认为以个体行为为主;然而在一些复杂的生存环境中,细菌也需要借助一定的群体行为:如生物膜的形成,群体感应现象和多细胞子实体形态的发生来抵抗不利环境。粘细菌以其复杂的多细胞群体行为特性而成为研究自然环境中菌株间的识别、协作和竞争的分子机制的有益模式菌株。研究者们发现在一个小的生态位内不同的粘细菌菌株之间能够自我识别。Smith和Dworkin (Smith and Dworkin,1994)将两株分属于不同种的粘球菌混合在一起进行发育时发现两株菌株可以各自形成自己的子实体,只是一株菌株会完全抑制另外一株菌株孢子的形成。随后Fiegna和Velicer (2005)进一步利用分离自不同生境的九株粘球菌菌株对这一现象进行了更为深入的验证和分析。他们的研究结果表明多数菌株的两两混合会导致其中至少一株菌株的生孢能力的下降,随后他们的研究还发现即使在营养扩展阶段,菌株之间也存在着一定的不相容性。将两株不同的粘球菌菌株进行临近点接扩展时,总会存在着明显的扩展边界而无法扩展融合,只有同一株菌株才能够实现完全的扩展融合。这也就表明在粘球菌的适应进化中不仅包含了由陆地到海洋的适应进化还包括了菌株在自然生境中借助于群体行为所展现出的识别、协作和竞争的进化出现。 粘细菌所展现出的这种对环境的适应行为引起了我们极大的研究兴趣,因此本论文从两个方面对粘球菌及其细胞群体行为环境适应的分子机制展开研究: (Ⅰ)以海洋耐盐粘球菌Myxococcus fulvus HW-1为研究材料,对HW-1适应海洋陆地两种生存环境变换的分子机制进行了探究。首先利用随机转座质粒对HW-1野生菌株进行随机突变,进而筛选与盐离子耐受及多细胞行为维持相关的基因。我们对实验中获得的300多株突变株进行筛选得到了两株耐盐能力显著下降的突变株,并对其中一株突变株YLH0401中发生插入失活的基因进行了定位确认及功能分析。该突变株在液体培养基中分散生长,耐盐能力显著下降,群体运动能力下降,子实体发育和生孢能力几乎丧失。随后的研究进一步揭示出YLH0401中基因的失活可能引起HW-1菌株的胞外基质的显著减少,从而导致了菌株多细胞群体行为的丢失或减弱。生物信息学及对失活基因存在的广泛性分析则发现,该失活基因是通过水平转移而来的外源基因,其在多株耐盐菌株中存在且具有一定的保守性,而在陆生的模式菌株和标准菌株中则不存在。鉴于该基因在高耐盐菌株中存在的特异性及其在HW-1多细胞行为及耐盐能力维持中的重要作用,我们推测该基因可能是海洋粘细菌为了更好地适应海洋环境而获取的外源基因。该基因的发现表明在陆地粘细菌向海洋进化的过程中其可能借助于水平转移获得的外源基因来更好的增强和维系多细胞行为以对抗海洋生境带来的生存压力。 其次在前期本课题组利用微阵列技术分析了与信号转导和应答适应相关的来自HW-1基因组的双组分系统相关基因在淡水和海水表达条件下的差异。承接上述研究结果,本论文进一步分析了在淡水和海水条件下显著差异表达基因的基本功能及其在HW-1环境适应中的作用。对这些显著差异表达基因在HW-1和模式菌株DK1622中的同源性进行了比对分析,发现这些基因在HW-1和DK1622中具有很高的同源性,这暗示着功能的相似性。在此基础上利用基因敲除的方法,我们成功地在模式菌株DK1622中获得了23个基因缺失的突变株。首先对获得的海水条件下最为显著差异表达的两个基因的功能进行了研究。我们发现HW-1中海水条件下最为显著上调表达基因的同源基因MXAN4042在DK1622中的缺失不仅导致了菌株耐受盐离子能力的降低,而且还导致了菌株在含有海水离子情况下生孢能力的极大减弱;而HW-1中海水条件下最为显著下调表达基因的同源基因MXAN31D6在DK1622中的缺失不但极大地提高了菌株的耐盐生长能力,而且同时极大地提高了菌株的耐盐生孢能力。这两个基因的失活所引起的陆生粘球菌在海水条件下适应性行为变化暗示着这两个基因在HW-1适应海洋环境中具有重要的作用。随后我们又对剩余的21株突变株的耐盐生长能力及淡海水条件下子实体发育行为和生孢能力进行了分析。我们发现在这21个基因中有10个基因是参与粘球菌适应海水盐浓度的调控的,这进一步证实了双组分系统相关基因在细胞环境适应调控中的重要作用。综合前期的微阵列实验结果和对这23个显著差异表达的基因及其功能的分析结果,我们进一步发现HW-1可能是依赖于在转录水平上调节某些基因的表达变化来适应海洋和陆地环境的变换,而很显然这种调控方式是快速而简捷的。 借助于微阵列技术可以批量筛选和分析与海水适应相关的基因,进而克服了由于HW-1遗传体系的不完善和较低的转座效率带来的研究障碍;而随机突变筛选还有可能获得一些HW-1的基因组中的特有基因,为我们分析基因组扩展与环境适应的关系提供一定的依据。综合以上两方面的实验结果,我们推测海洋耐盐粘细菌在适应海洋环境的进化过程中除了通过在转录水平上快速地调控基因的表达来适应海陆环境的变换之外,还借助于水平转移而来的外源基因来更好地增强和维系多细胞行为以对抗海洋环境所带来的生存压力。 (Ⅱ)群体运动即S运动在粘球菌的多细胞群体行为维系中发挥着重要作用。S运动的主要胞外器官Tfp是由pilA基因编码蛋白单体pilin组装形成的。早在2002年Velicer等人在研究中发现在经过人工进化而导致S运动丢失的粘球菌菌株中,多数是因为pili基因簇中的基因发生突变导致的(Velicer and Stredwick,2002)。随后的研究中我们发现pilA基因的序列组成具有典型性即包含了高度保守的N端编码序列和高度可变的C端编码序列。这也就揭示着在粘细菌多细胞行为进化适应的过程中pilA基因序列可能是多样性进化的。粘球菌群体运动主要胞外器官pili的多样化进化产生与自然环境中粘细菌菌株所展现出的不相容性(自我识别现象)可能具有一定的相关性。因此在本部分实验中我们以pilin单体的编码基因pilA基因为着眼点,首先对自然环境中粘球菌菌pilin基因序列的多样性进行了分析,然后比较分析了这些pilA基因的功能。综合多种PCR方法最终我们成功获得了59株粘球菌的pilA基因序列。经过同源比对分析将这59个序列分为13类同源性较低的序列,但是每一类中的序列又是高度同源的。这些序列表现出的聚类性在一定程度上也反应了菌株之间在进化地位上的相关性。随后我们成功的构建了八株包含有不同pilA基因的回补菌株,并分析了回补菌株中pilA基因对DK10410的多细胞群体运动能力的恢复情况。结果表明八个pilA基因均能够回复DK10410的多细胞群体运动,从回补菌株的EPS产生能力上来看,这些外源的pilA基因均能够诱导EPS产生从而恢复S运动。本文分析结果为pili参与多糖产生调控途径提供了又一有力的实验证据,同时也表明自然环境中粘球菌的群体运动行为机制与模式菌株的运动机制是极为类似的。 在此基础上借助于回补菌株我们又进一步探讨了pili在粘球菌的自我识别过程中的作用,期望可以初步阐明自然环境中粘球菌自我识别的机制。首先分析了pili在粘球菌菌株扩展边界出现中发挥的作用,实验结果表明pili在粘球菌菌株的这种自我识别中发挥着一定的作用。但是这种识别并不是完全受pili主导的,可能还有其他的胞外组分发挥着一定的作用。其次利用菌株的两两混合发育分析了pili在菌株发育阶段自我识别中的作用。当DK1622与包含有外源pilA的回补菌株混合发育时,回补菌株与DK1622可以形成混合的子实体。这部分结果也暗示着当菌株的遗传背景相同,而仅仅pili不同时,菌株并不能够相互区别。当pili回补菌株与野生菌株混合发育时,出现的情况比较多样化,即:有的野生菌株完全抑制了回补菌株的发育,有的野生菌株可以和回补菌株互不干扰形成相互独立的子实体,另外还有野生菌株可以和回补菌株形成混合的子实体。这也就是说当DK1622中的pili置换为野生菌株的pili时,其与野生菌株的混合发育的情况确实不同于DK1622与野生菌株的混合发育,而且存在着混合子实体形成的情况。这些结果初步说明pili在发育阶段菌株的自我识别中也发挥着一定作用。作为粘球菌群体运动的主要胞外器官pili组成单体的编码基因,pilA多样性的进化产生对于自然环境中粘球菌的相互识别、竞争和协作等群体行为进化具有重要意义。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q935

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