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《山东大学》 2010年
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冷冻对人精子核DNA损伤、凋亡、线粒体膜电位的影响

张建瑞  
【摘要】: [目的]精子冷冻技术已经被广泛应用于生殖领域,它可以为人类提供生殖保险,为不孕不育夫妇提供合格的精子。但是冷冻过程中冰晶的形成以及氧化应激反应会对精子造成损伤(包括精子细胞膜、DNA、精子活力、线粒体功能等),运动能力的减弱、DNA的损伤则导致了精子授精能力的下降。线粒体是定位于精子尾部的能量供应中心,和精子运动能力密切相关;同时线粒体又是凋亡通路之一,在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用,而线粒体跨膜电位的下降,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件。在本研究中,我们主要观察:1.冷冻储存对精子的运动能力、畸形率、膜脂类过氧化反应、DNA损伤及线粒体膜电位、凋亡等的影响及各项指标之间是否存在相关性。2.比较冷冻对正常、异常精液影响的大小,以便对以后的自精保存工作提出指导意见。 [方法]2009年3月~6月于山东省人类精子库(山东大学附属省立医院)随机选取正常精液样本、异常精液样本各30例(根据世界卫生组织1999年的标准:精子密度20×109/L,活动率60%,a级精子25%或a+b级精子50%,精子正常形态率30%为正常精液,其他为异常精液)。志愿者禁欲3-7d,留取精液于无菌瓶内,在室温下完全液化后,行精液常规检查。所有标本均采用Endtz实验排除白细胞精子症者。每份精液标本留取1mL,其中0.5ml精液用于检测冻前指标。采用精子形态学快速染色(Diff-Quik法)试剂盒检测精子的畸形率,应用MDA试剂盒检测精子膜脂类过氧化反应产物丙二醛,荧光染料吖啶橙标记精子DNA,荧光显微镜下检测精子DNA损伤,荧光染料罗丹明(Rhl23)标记精子线粒体,流式细胞仪检测线粒体膜电位。annexinV-FITC试剂盒检测精子凋亡变化。另外0.5ml精液冷冻复苏后检查前述指标。本研究通过本院伦理委员会批准,并获得志愿者知情同意。 [结果]①正常精液组中:精子正常形态降低明显、氧化应激值(MDA)升高显著、线粒体膜电位下降明显、凋亡精子比率下降明显、死亡精子比率升高显著,均具有统计学意义。 ②异常精液组中:精子正常形态降低明显、MDA升高显著、DNA损伤率升高、线粒体膜电位下降明显、活精子及凋亡精子比率下降明显、死亡精子比率升高显著,均具有统计学意义。 ③两组之间的比较:冷冻造成异常精液组中精子正常形态损伤、DNA损伤明显、死亡精子比率升高、凋亡精子比率下降均高于正常精液组,均具有统计学意义。 ④相关分析:凋亡精子AN+/PI-的比率与精子的密度呈正相关关系,精子的MMP和精子活动力(a+b)呈正相关关系,MDA值与DNA损伤率呈正相关。相反。活精子AN-/PI-的比率与精子密度呈现负相关关系。死精子AN+/PI+的比率与精子正常形态及精子线粒体膜电位呈现负相关关系。精子正常形态与MDA值呈负相关。 [结论]虽然冷冻均可造成正常精液、异常精液的损伤,但冷冻造成异常精液损伤较正常精液损伤较大。在自精保存工作中,如果精液质量较低,应将冷冻精子可能造成损伤的风险充分告知自精保存者。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R698.2

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